来自大麻的大麻环萜酚酸合酶制造技术

技术编号:16047174 阅读:434 留言:0更新日期:2017-08-20 06:25
本发明专利技术公开了来自大麻的核酸分子,其已经被分离和表征并编码具有大麻环萜酚酸合酶活性的多肽。核酸的表达或过表达会改变大麻素化合物的水平。所述多肽可用于体内或体外生产大麻素化合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】来自大麻的大麻环萜酚酸合酶相关申请这是一项专利合作条约申请,其在于2014年6月27日提交的美国临时专利申请No.62/018,128的基础上要求35U.S.C.§119的权益,该申请以引用的方式全文并入本文。专利
本专利技术涉及来自大麻的大麻环萜酚酸合酶(CBCAS),编码基于酶CBCAS的试剂的核苷酸序列,和用于生产大麻素和/或改变大麻素生产的方法。专利技术背景大麻(CannabissativaL.;cannabis,hemp,marijuana)是一种最古老且用途最广的种植植物,现今发现它可用作药品、食品、化妆品和工业产品的来源。大麻还因含有作用于精神的大麻素(如Δ9-四氢大麻酚,THC)而用作非法毒品而闻名。目前正在探索作用于哺乳动物大麻素受体的源自植物的大麻素和其它药物作为药品和/或用于不同病症的治疗,所述病症如慢性疼痛、多发性硬化症中的神经性疼痛、厌食、恶心、癌症/AIDS消瘦和痉挛(Ware等,2010;Pertwee,2005)。已知来自大麻的超过80种大麻素(Elsohly和Slade,2005)。主要的酸性大麻素是Δ9-四氢大麻酚酸(THCA)、大麻二酚酸(CBDA)和大麻环萜酚酸(CBCA)。加热或长期储存会导致酸性大麻素的脱羧(如THCA形成THC、CBDA形成大麻二酚(CBD)和CBCA形成大麻环萜酚(CBC))。在分子和酶水平上越来越多地了解大麻素生物合成途径。第一酶是己酰辅酶A合成酶(Stout等,2013)。将己酰辅酶A(CoA)用作涉及两种酶(丁烯酮(tetraketide)合酶和戊基二羟基苯酸(olivetolicacid)环化酶)的反应的底物,这两种酶一起起作用以合成戊基二羟基苯酸(Gagne等,2012)。通过芳香族异戊烯基转移酶将戊基二羟基苯酸香叶基化(geranylated)以形成大麻萜酚酸(CBGA)(Fellermeier和Zenk,1998),其是通过氧化环化酶转化为THCA、CBDA或CBCA的分支点中间体。已经克隆和表征了THCA合酶和CBDA合酶(Sirikantaramas等,2005;Taura等,2007)。尚未报道编码CBCA合酶的基因。在vanBakel等(2011)中报道了大麻(Cannabisstativa)的基因组序列。然而没有鉴定CBCA合酶的序列。遗传证据表明,尽管THCA合酶和CBDA合酶在相同的基因座上可以是等位的,但是CBCA合酶与这些其它酶是不连锁的(deMeijer等,2009,deMeijer等,2003)。Kojoma等(2006)报道了“药物型”和“纤维型”大麻中THCA合酶基因中的DNA多态性。大麻素是珍贵的源自植物的天然产物。编码大麻素生物合成酶的基因可用于含有超低水平THC和其它大麻素的大麻种类的代谢工程中。这些基因还可证明可用于产生特定大麻种类,用于生产基于大麻素的药物,用于生产催化大麻素形成步骤的酶,或用于在其它生物体如细菌或酵母菌中重建大麻素生物合成。
技术实现思路
一方面,提供一种分离的和/或纯化的核酸分子,所述核酸分子包含:i)核苷酸序列,所述核苷酸序列与SEQIDNO:1或5具有至少、大于或约96%的序列同一性;ii)核苷酸序列,所述核苷酸序列与SEQIDNO:1、5或8或9具有至少、大于或约78%的序列同一性并编码具有大麻环萜酚酸合酶活性的多肽;iii)i)或ii)的补体;或者i)、ii)或iii)的大于、至少或约15个连续核苷酸的片段。此外,另一方面,提供引物和探针,所述引物和探针包含与SEQIDNO:1、5或8或9的片段具有至少、大于或约96%的序列同一性的核苷酸序列或其补体。另一方面是一种核酸分子,所述核酸分子编码与SEQIDNO:2或6具有至少、大于或约95%的序列同一性的多肽,可选地针对在除大麻之外的生物体中的表达进行了密码子使用(codonusage)优化。在一个实施方案中,所述核酸分子包含具有SEQIDNO:1、5、8或9的序列的核苷酸序列。另一方面,提供一种分离的和/或纯化的多肽,所述多肽包含与SEQIDNO:2或6具有至少、大于或约95%的序列同一性的氨基酸序列。另一方面,还提供一种本文描述的连接至异源信号序列或标签的核酸分子。在一个实施方案中,所述核酸分子包含编码多肽的核苷酸序列,该多肽具有的氨基酸序列与连接至异源信号序列或标签的SEQIDNO:2或6具有至少、大于或约95%的序列同一性。另一方面,还提供一种抗体或其结合片段,所述抗体或其结合片段特异性结合本文所述的SEQIDNO:2或6或者其片段中的氨基酸序列的表位。另一方面包括一种核酸分子,所述核酸分子包含:i)核苷酸序列或其补体,所述核苷酸序列与SEQIDNO:1或5具有至少约96%的序列同一性;或ii)核苷酸序列,所述核苷酸序列与SEQIDNO:1、5、8或9具有至少、大于或约78%的序列同一性并编码具有大麻环萜酚酸合酶活性的多肽;可操作地与适于在细胞或生物体中表达的异源核酸序列连接。还提供载体构建体,所述载体构建体包含:i)核苷酸序列或其补体,所述核苷酸序列与SEQIDNO:1或5具有至少约96%的序列同一性;或ii)核苷酸序列,所述核苷酸序列与SEQIDNO:1、5、8或9具有至少、大于或约78%的序列同一性并编码具有大麻环萜酚酸合酶活性的多肽;可操作地与适于在细胞或生物体中表达的异源核酸序列连接。另一方面包括一种包含核酸的细胞或生物体,所述核酸包含:与SEQIDNO:1或5具有至少约96%的序列同一性的核苷酸序列,或与SEQIDNO:1、5、8或9具有至少、大于或约78%的序列同一性的核苷酸序列并编码具有大麻环萜酚酸合酶活性的多肽;和/或表达包含与SEQIDNO:2或6具有至少约95%的序列同一性的氨基酸序列的重组多肽。再一方面包括一种组合物,所述组合物包含本文所述的分离的核酸、分离的多肽、载体构建体、细胞或抗体或其片段。再又一方面,提供一种改变生物体、细胞或组织中大麻素化合物的水平的方法,所述方法包括在生物体、细胞或组织中表达或过表达本专利技术的核酸分子或多肽。另一方面,提供一种改变生物体、细胞或组织中大麻素化合物的水平的方法,所述方法包括引入本专利技术的核酸分子或载体构建体或其片段,以使生物体、细胞或组织中的CBCAS沉默和/或低表达。大麻环萜酚酸合酶和编码这种酶的核苷酸序列现已经被鉴定和表征。所述核苷酸序列可用于通过筛选或遗传工程产生过量或不足量产生大麻素化合物或其混合物的大麻植物。包含SEQIDNO:1和5的核苷酸序列的片段(如至少15个核苷酸长度)的引物和探针可用于鉴定大麻环萜酚酸合酶中的突变体或变体。这种大麻环萜酚酸合酶的核苷酸序列还可单独或与编码大麻素合成途径中其它酶的核酸分子组合表达,以在其它植物或在微生物(如酵母菌、细菌、真菌)或其它原核或真核生物体中工程化大麻素生物合成。此外,敲除大麻中该基因的表达可以用来阻断大麻素生物合成和由此降低大麻素的产量。根据以下的详细描述过程,进一步特征将得以阐释或变得显而易见。附图简述为了更清晰地理解本专利技术,结合附图将其实施方案以实施例的形式进行详细描述,其中:图1示出一种在大麻中得到主要大麻素类型的建议途径。缩写:THCA合酶是Δ9-四氢大麻酚酸合酶;CBDA合酶本文档来自技高网
...
来自大麻的大麻环萜酚酸合酶

【技术保护点】
一种分离的核酸分子,所述分离的核酸分子包含:i)核苷酸序列,所述核苷酸序列编码具有如SEQ ID NO:2或6所示序列的多肽或与SEQ ID NO:2或6具有至少96%的序列同一性的多肽;ii)核苷酸序列,所述核苷酸序列与SEQ ID NO:1或5具有至少、大于或约96%的序列同一性;iii)核苷酸序列,所述核苷酸序列与SEQ ID NO:1、5或8或9具有至少、大于或约78%的序列同一性并编码具有大麻环萜酚酸合酶活性的多肽;iv)核苷酸序列,所述核苷酸序列是i)、ii)或iii)的补体;或v)i)、ii)、iii)或iv)中任何一个的片段,所述片段包含i)、ii)、iii)或iv)的大于、至少或约15个连续核苷酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.06.27 US 62/018,1281.一种分离的核酸分子,所述分离的核酸分子包含:i)核苷酸序列,所述核苷酸序列编码具有如SEQIDNO:2或6所示序列的多肽或与SEQIDNO:2或6具有至少96%的序列同一性的多肽;ii)核苷酸序列,所述核苷酸序列与SEQIDNO:1或5具有至少、大于或约96%的序列同一性;iii)核苷酸序列,所述核苷酸序列与SEQIDNO:1、5或8或9具有至少、大于或约78%的序列同一性并编码具有大麻环萜酚酸合酶活性的多肽;iv)核苷酸序列,所述核苷酸序列是i)、ii)或iii)的补体;或v)i)、ii)、iii)或iv)中任何一个的片段,所述片段包含i)、ii)、iii)或iv)的大于、至少或约15个连续核苷酸。2.根据权利要求1所述的分离的核酸分子,其中,所述核苷酸序列如SEQIDNO:1、3、4或5中所示或为其密码子简并核苷酸序列,可选地,其中所述密码子简并核苷酸序列包含如SEQIDNO:8或9中所示的序列或前述中任何的补体。3.一种具有大麻环萜酚酸合酶活性的分离的多肽,所述分离的多肽包含与SEQIDNO:2或6的全部或片段具有至少约96%的序列同一性的氨基酸序列。4.根据权利要求3所述的分离的多肽,其中,所述氨基酸序列如SEQIDNO:2或6中所示。5.根据权利要求1或2所述的分离的核酸分子或者根据权利要求3或4所述的分离的多肽,其中,所述分离的核酸分子或所述分离的多肽与一个或多个异源部分,可选地连接子、单个序列、可检测标记或如纯化标签的标签中的一种或多种耦合。6.一种包含权利要求1或2中定义的核酸分子的构建体或体外表达系统。7.一种生物体、细胞或组织,其包含权利要求1、2或5中任一项所述的分离的核酸分子或者权利要求6所述的构建体,和/或表达权利要求3-5中任一项所述的分离的多肽。8.一种调节生物体、细胞或组织中大麻素化合物的水平的方法,所述方法包括:i)引入并表达权利要求1、2或5...

【专利技术属性】
技术研发人员:J·E·佩奇J·M·斯托特
申请(专利权)人:加拿大国家研究委员会
类型:发明
国别省市:加拿大,CA

网友询问留言 已有0条评论
  • 还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。

1