鼠伤寒沙门菌aroA和luxS双基因缺失株及其制备的弱毒疫苗制造技术

本发明专利技术提供了一种鼠伤寒沙门菌aroA和luxS双基因缺失株及其制备的弱毒疫苗，其中的鼠伤寒沙门菌aroA和luxS双基因缺失株，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.13736。该缺失株利用Red同源重组方法缺失aroA和luxS两个基因得到，所以毒力得到显著降低，制备得到的鼠伤寒沙门菌双基因缺失弱毒疫苗免疫保持良好，所以可以用于制备防治鼠伤寒沙门菌感染的鼠伤寒沙门菌双基因缺失弱毒疫苗。

【技术实现步骤摘要】
鼠伤寒沙门菌aroA和luxS双基因缺失株及其制备的弱毒疫苗
本专利技术属于生物
，具体涉及一种鼠伤寒沙门菌aroA和luxS双基因缺失株及其制备的弱毒疫苗。
技术介绍
沙门菌是一种重要的食源性人兽共患病病原菌，不仅能引起多种畜禽疾病(鸡白痢、鸡伤寒、鸡副伤寒、猪副伤寒等)，造成全身性败血症和肠炎，给养殖业造成严重经济损失，而且能够通过污染食物引起人类食物中毒，对人类健康造成严重威胁。鼠伤寒沙门菌可以感染很多家禽、家畜、鼠、鸟和冷血动物，且蝇、蚤可带菌传播。人类通常是由于摄入被污染的蛋类或未完全煮熟的肉类而感染沙门菌，而且，鼠伤寒沙门菌感染的发病率居沙门菌感染的首位，可导致医院感染和暴发性食物中毒，病死率较高，因此造成的危害和经济损失巨大。目前，主要采用抗生素类药物来预防和治疗鼠伤寒沙门菌病，但由于抗生素的广泛使用，导致了鼠伤寒沙门菌的耐药性和耐药谱的不断变化。另外，大量使用抗生素，极易造成畜禽产品出现药物残留，进而直接影响食品的安全，这不仅关系到畜牧业生产和畜牧业经济的发展，还关系到人类的身体健康和生存环境。因此，国内外逐渐采用疫苗接种的方法来预防沙门菌感染。但是，由于沙门菌灭活苗需要经皮下多次接种，使用不方便，且不能诱导产生消化道局部保护力和细胞免疫，无法提供有效的保护效果。而弱毒活疫苗能够模拟自然感染状况，可以诱导细胞、体液和黏膜免疫，免疫力坚实，免疫期长。因此，利用基因工程技术构建基因缺失株，用作新型减毒活疫苗的研究备受关注。国内外的研究表明，调控基因以及代谢相关基因的缺失、改造和修饰，都可以降低细菌的毒力，如aroA和luxS等，其中aroA基因编码芳香族氨基酸生物合成途径中的3-烯醇丙酮酰莽草酸-5-磷酸合成酶，该基因的功能缺失导致细菌的生长需要酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸等，在缺乏这些代谢产物的情况下，细菌的生长会受到抑制。此外，aroA突变株所需要的芳香族代谢产物没有在脊椎动物组织中发现，包括人体组织，确保了其在哺乳动物体内有限的复制，减少了在野外条件下散毒的风险。而luxS基因是构成LuxS/AI-2型密度感应系统的关键基因，对沙门菌的致病力具有重要的调控作用。
技术实现思路
本专利技术提供鼠伤寒沙门菌aroA和luxS双基因缺失株及其制备的弱毒疫苗，以达到安全预防鼠伤寒沙门菌感染的作用。为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：本专利技术提供了一种鼠伤寒沙门菌aroA和luxS双基因缺失株，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.13736。进一步的，本专利技术还提供了一种上述的鼠伤寒沙门菌aroA和luxS双基因缺失株在制备鼠伤寒沙门菌双基因缺失弱毒疫苗中的应用。进一步的，本专利技术还提供了一种采用上述的鼠伤寒沙门菌aroA和luxS双基因缺失株制备得到的鼠伤寒沙门菌双基因缺失弱毒疫苗。专利技术作用与效果本专利技术构建提供的鼠伤寒沙门菌aroA和luxS双基因缺失株及其应用以及由其制备的弱毒疫苗，构建得到的鼠伤寒沙门菌aroA和luxS双基因缺失株，其毒力明显降低，且可以显著降低细菌在感染宿主体内的增殖能力，制备得到的鼠伤寒沙门菌双基因缺失弱毒疫苗免疫保持良好，所以可以用于制备防治鼠伤寒沙门菌感染的鼠伤寒沙门菌双基因缺失弱毒疫苗。附图说明图1为实施例一涉及的鼠伤寒沙门菌aroA单基因缺失株SAT52ΔaroA和双基因缺失株SAT52ΔaroA-luxS在脾脏中的定殖清除情况；图2为实施例一涉及的鼠伤寒沙门菌aroA单基因缺失株SAT52ΔaroA和双基因缺失株SAT52ΔaroA-luxS在肝脏中的定殖清除情况。具体实施方式以下结合附图来说明本专利技术的具体实施方式。对于实施例中所用到的具体方法或材料，本领域技术人员可以在本专利技术技术思路的基础上，根据已有的技术进行常规的替换选择，而不仅限于本专利技术实施例的具体记载。实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例一1.鼠伤寒沙门菌aroA和luxS双基因缺失株及其构建。本专利技术提供的鼠伤寒沙门菌aroA和luxS双基因缺失株是利用Red同源重组的方法构建的，具体包括以下步骤：步骤1，aroA打靶片段构建，根据pKD3序列设计第一引物对，第一引物对中的两个引物的5＇端分别含有aroA基因的上游基因和aroA基因的下游基因，以pKD3为模板，采用第一引物对通过PCR扩增氯霉素抗性基因得到含有aroA基因的上游基因和aroA基因的下游基因的aroA打靶片段，如表1所示，本实施例中，第一引物对名称为aroA缺失-F和aroA缺失-R，其序列见表1，aroA基因的上游基因和aroA基因的下游基因的序列为相应引物序列中的下划线部分。步骤2，luxS打靶片段构建，根据pKD3序列设计第二引物对，第二引物对中的两个引物的5＇端分别含有luxS基因的上游基因和luxS基因的下游基因，以pKD3为模板，采用第二引物对通过PCR扩增氯霉素抗性基因得到含有luxS基因的上游基因和luxS基因的下游基因的luxS打靶片段，如表1所示，本实施例中，第二引物对名称为luxS缺失-F和luxS缺失-R，其序列见表1，luxS基因的上游基因和luxS基因的下游基因的序列为相应引物序列中的下划线部分；步骤3，基因缺失株筛选，采用含有pKD46的鼠伤寒沙门菌SAT52菌株，依次将aroA打靶载体和luxS打靶载体全部进行转化，筛选得到鼠伤寒沙门菌的aroA基因缺失株或luxS基因缺失株，具体包括以下子步骤：步骤3.1，感受态细胞准备，将含有pKD46的鼠伤寒沙门菌SAT52菌株在温度条件为28℃下培养后，加入L-阿拉伯糖诱导Red重组系统充分表达后，在6000g的离心率、4℃的离心温度下进行5min的离心，然后收集得到菌体，采用10％的甘油对离心后收集的菌体洗涤两次后，再用10％甘油重悬后分装得到第一感受态细胞和第二感受态细胞；步骤3.2，转化，将aroA打靶载体加入到第一感受态细胞中，进行电转化，电击参数为：电压2300V，电容25μF，电阻200Ω，然后加入LB培养基，在在37℃摇床中复苏1h后，涂布于含氯霉素的LB平板，在37℃下培养过夜得到氯霉素抗性克隆菌落；步骤3.3，目的菌株筛选，挑取单个步骤3.2中得到的氯霉素抗性克隆菌落培养，进行PCR鉴定筛选得到aroA基因缺失株，其中用到的引物及相应的序列如表1所示，分别为：使用引物对aroA内部检测-F和aroA内部检测-R，引物对aroA外部检测-F和aroA外部检测-R。根据PCR鉴定结果表明，成功获得鼠伤寒沙门菌SAT52株的aroA基因缺失株，命名为aroA单基因缺失株SAT52ΔaroA；步骤3.4，基于步骤3.3得到的aroA基因缺失株制备第二感受态细胞，采用luxS打靶片段和第二感受态细胞，并重复和步骤3.2-步骤3.3一样的步骤，进一步缺失luxS基因，再进行PCR鉴定筛选，从而得到鼠伤寒沙门菌aroA和luxS双基因缺失株，此时用到的引物及其相应的序列如表1所示，分别为：引物对luxS内部检测-F和luxS内部检测-R，引物对luxS外部检测-F和luxS外部检测-R进行PCR鉴定。根据上述步骤构建的鼠伤寒沙门菌a本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鼠伤寒沙门菌aroA和luxS双基因缺失株，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.13736。

【技术特征摘要】
1.一种鼠伤寒沙门菌aroA和luxS双基因缺失株，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNO.13736。2.一种如权利要求1所述的鼠伤寒沙门菌aroA和lu...

【专利技术属性】
技术研发人员：于圣青，王少辉，杨登辉，吴晓君，丁铲，
申请(专利权)人：中国农业科学院上海兽医研究所，
类型：发明
国别省市：上海,31