一种细胞贴壁因子及其试剂和包被液制造技术

本发明专利技术涉及一种细胞贴壁因子，以及采用该细胞贴壁因子的细胞贴壁试剂和包被液，以及采用该包被液处理后的细胞培养容器，以及它们在培养干细胞或T淋巴细胞方面的应用。本发明专利技术的细胞贴壁因子为为具有如SEQ No.1所示的氨基酸序列的化学合成多肽，一方面其具有多个ECM蛋白的功能区域，可以提供多种ECM蛋白的功能，可以使得细胞如同在原本的生长环境中贴壁生长，提高细胞的生长速度，另一方面，其化学成分明确，配方质量稳定，不使用细菌或真菌，不存在细菌或真菌碎片，可以避免残留碎片或其他杂质对细胞生长的危害，安全性更高，可以安全地应用于临床治疗。

Cell wall adhering factor, reagent and package liquid thereof

The invention relates to a cell attachment and cell factor, the factor of adherent cells adherent reagent and coating liquid, and the encapsulated cells treated the culture vessel, and their application in the culture of stem cells or T lymphocytes of the. The chemical synthesis of the polypeptide of adherent cells factor with amino acid sequence of SEQ represented by No.1, a functional area having a plurality of ECM protein, ECM protein can provide a variety of functions, can make the cell wall as in the original growth environment of growth, improve the rate of cell growth. On the other hand, the chemical composition of formula of clear, stable quality, without the use of bacteria or fungi, there is no bacterial or fungal debris, can avoid the harm of residual debris or other impurities on cell growth, high safety, and can be used safely in clinical treatment.

【技术实现步骤摘要】
一种细胞贴壁因子及其试剂和包被液
本专利技术属于细胞培养
，具体涉及一种细胞贴壁因子，以及采用该细胞贴壁因子的细胞贴壁试剂和包被液，以及采用该包被液处理后的细胞培养容器，以及它们在培养干细胞或T淋巴细胞方面的应用。
技术介绍
高等生物细胞除了循环运输类细胞以外，一般都是固定生长、必须贴附在基质上生长，此基质被称为细胞外基质(ExtracellularMatrix，ECM)。对于干细胞的体外培养来说，ECM的提供是必须的。已知的ECM为多层网状结构，主要包含胶原蛋白、弹性蛋白、蛋白多糖和糖蛋白等。细胞贴附到细胞外的间质糖蛋白上(类似纤维网蛋白)，以利细胞的生长、伸展与分化。血清是这些糖蛋白的丰富来源，但却相当昂贵且难以分离，因此限制了细胞大量培养能力。在不加入血清的培养基中，通常需要另加入一些贴壁因子(也称贴附因子)。目前一些已知的贴壁因子，大多是以单一蛋白或多个不同蛋白混和物。通常来说，以多个不同蛋白的混合物作为贴壁因子的细胞生长效果较单一种蛋白的好，这背后的原因据推测可能是由于不同蛋白分别提供不同的功能区域，从而使细胞能更好的生长。为了能够大量生产这些蛋白(贴壁因子)，通常是利用细菌或是真菌的表达系统来制造，然而在纯化提取的时候，常容易残留细菌或是真菌的碎片，会造成一些不利于细胞生长的问题，特别是，当培养的细胞要应用于人体治疗时，残留的细菌碎片将对人体造成过敏反应，严重危害病人的生命安全。因此，本领域希望能够研发一种无细菌或无真菌残留，化学成分明确的贴壁因子以及试剂。
技术实现思路
鉴于相关技术的上述问题和/或其他问题，本专利技术一方面提供了一种细胞贴壁因子，该细胞贴壁因子为具有如SEQNo.1所示的氨基酸序列的化学合成多肽。本专利技术再一方面提供了一种细胞贴壁试剂，所述细胞贴壁试剂含有如上述的细胞贴壁因子。优选的，所述细胞贴壁试剂为所述细胞贴壁因子与磷酸盐缓冲液的混合液。优选的，所述细胞贴壁试剂还含有丙三醇和药用乙醇。优选的，每毫升所述细胞贴壁试剂含有5-15mg所述细胞贴壁因子、100μl磷酸盐缓冲液、100μl丙三醇和800μl药用乙醇。本专利技术还一方面提供了一种用于促进细胞贴壁的包被液，所述包被液含有上述的细胞贴壁因子，且所述细胞贴壁因子的浓度为5-15μg/ml；并且，所述包被液是通过将上述的细胞贴壁因子溶解于磷酸盐缓冲液配制而成；或者，所述包被液是采用磷酸盐缓冲液将上述的细胞贴壁试剂稀释配制而成。本专利技术还一方面一种细胞培养容器，所述细胞培养容器具有供细胞贴壁的内壁，所述内壁经过包被处理，所述包被处理采用如上述的用于促进细胞贴壁的包被液。优选的，所述包被处理是将上述的用于促进细胞贴壁的包被液均匀地涂布于所述内壁，并在4～30摄氏度下包被1～6小时，最后弃去所述内壁上残留的包被液。本专利技术还一方面提供了上述的细胞贴壁因子、上述细胞贴壁试剂、上述的包被液以及上述的细胞培养容器在培养干细胞或免疫细胞方面的应用。优选的，所述免疫细胞为淋巴细胞或树突状细胞。优选的，所述淋巴细胞为CIK细胞。本专利技术的细胞贴壁因子为一化学合成多肽，一方面其具有多个ECM蛋白的功能区域，可以提供多种ECM蛋白的功能，可以使得细胞如同在原本的生长环境中贴壁生长，提高细胞的生长速度，另一方面，其化学成分明确，配方质量稳定，不使用细菌或真菌，不存在细菌或真菌碎片，可以避免残留碎片或其他杂质对细胞生长的危害，安全性更高，可以安全地应用于临床治疗。附图说明图1为应用例1的细胞贴壁生长的相差光学显微镜图片；图2为对比例1的细胞贴壁生长的相差光学显微镜图片；图3为对比例2的细胞贴壁生长的相差光学显微镜图片；图4为对比例3的细胞贴壁生长的相差光学显微镜图片。具体实施方式以下通过实施例对本专利技术作进一步的说明，但本专利技术并不限于这些具体实施方式。合成细胞贴壁因子在本专利技术的一个具体实施方案中，采用常规的多肽合成方法来合成具有如SEQNo.1所示的氨基酸序列的化学合成多肽；合成产物可以采用常规的多肽纯化方法来纯化，进而配制细胞贴壁因子。在本专利技术的一个优选实施方案中，采用9-芴甲氧羰基保护法来合成具有如SEQNo.1所示的氨基酸序列的化学合成多肽；合成产物采用HPLC纯化，进而配制细胞贴壁因子。在本实施例中，专利技术人委托生工生物合成具有如SEQNo.1所示的氨基酸序列，并进行纯化获得细胞贴壁因子。细胞贴壁试剂的配制在本实施例中，配制1L细胞贴壁试剂：取100ml的磷酸缓冲液、100ml的丙三醇和800ml的药用乙醇，混合均匀，再加入10g上述合成的细胞贴壁因子，搅拌使之溶解，从而获得1L细胞贴壁试剂，其中细胞贴壁因子的浓度为10mg/ml。将配制的细胞贴壁试剂置于棕色试剂瓶中，室温下，避光保存。用于促进细胞贴壁的包被液包被液的配制有两种方式：方式1：将上述合成的细胞贴壁因子溶解于磷酸缓冲液中，配制成细胞贴壁因子浓度为5-15μg/ml的包被液；方式2：取配制好的细胞贴壁试剂(含细胞贴壁因子5-15mg/ml)，采用磷酸盐缓冲液将其稀释至细胞贴壁因子的浓度为5-15μg/ml。本实施例中采用方式2，取上述配制的细胞贴壁试剂，用磷酸盐缓冲液稀释1000倍，稀释后细胞贴壁因子的浓度为5-15μg/ml。包被处理细胞培养容器细胞培养容器一般包括：培养瓶(按照底面积的大小分为各种规格)、培养皿(按照底面积的大小分为各种规格)和培养板(例如6孔板、12孔板、24孔板和96孔板)。一般来说，细胞扩增一般采用培养瓶。细胞培养容器中具有供细胞贴壁的内壁。将上述获得的包被液均匀地涂布在细胞培养容器的内壁上，例如细胞培养瓶的内壁，细胞培养皿的内壁等，在4～30摄氏度下包被1～6小时，最后弃去残留的包被液即可。在本实施例中，将上述获得的细胞贴壁因子的浓度为10μg/ml涂布于细胞培养皿(购自Corning公司，型号430639)的内壁，25摄氏度下包被1-2小时。包被处理完成后，即可将干细胞或免疫细胞放进去培养。应用例以及效果数据本应用例中以CIK细胞为例介绍，在上述经包被处理的细胞培养容器中进行细胞培养的过程。依照常规的淋巴细胞分离方法，首先从人类全血中分离出单核球淋巴细胞(PBMC)，并调整细胞浓度至1x106个PMBC/ml，再将该细胞溶液加入到上述经包被处理的细胞培养皿中，加入无血清培养基(购自BiologicalIndustries公司，型号05-080-1A)10ml，再放置于37摄氏度、5％CO2的细胞培养箱培养，培养三天后观察贴壁细胞(CIK细胞)的培养结果。应用例：采用上述经本实施例的包被液处理的细胞培养皿；对比例1：采用未经包被处理的细胞培养皿；具体的细胞培养过程同上述应用例；对比例2：采用经市售的贴壁溶液包被处理后的细胞培养皿，其中市售的贴壁溶液购自Corning公司，产品型号为356234，包被处理方法参照该产品的说明书；具体的细胞培养过程同上述应用例；对比例3：采用经市售的贴壁溶液包被处理后的细胞培养皿，其中市售的贴壁溶液购自BiologicalIndustries公司，产品型号为05-752-1H，包被处理方法参照该产品的说明书；具体的细胞培养过程同上述应用例；经过三天的培养，用相差光学显微镜观察并拍摄CIK细胞的贴壁生长情况；图1为应用例1的C本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种细胞贴壁因子，其特征在于：该细胞贴壁因子为具有如SEQ No.1所示的氨基酸序列的化学合成多肽。

【技术特征摘要】
1.一种细胞贴壁因子，其特征在于：该细胞贴壁因子为具有如SEQNo.1所示的氨基酸序列的化学合成多肽。2.一种细胞贴壁试剂，其特征在于：所述细胞贴壁试剂含有如权利要求1所述的细胞贴壁因子。3.如权利要求2所述的细胞贴壁试剂，其特征在于：所述细胞贴壁试剂为所述细胞贴壁因子与磷酸盐缓冲液的混合液。4.如权利要求3所述的细胞贴壁试剂，其特征在于：所述细胞贴壁试剂还含有丙三醇和药用乙醇。5.如权利要求4所述的细胞贴壁试剂，其特征在于：每毫升所述细胞贴壁试剂含有5-15mg所述细胞贴壁因子、100μl磷酸盐缓冲液、100μl丙三醇和800μl药用乙醇。6.一种用于促进细胞贴壁的包被液，其特征在于：所述包被液含有如权利要求1所述的细胞贴壁因子，且所述细胞贴壁因...

【专利技术属性】
技术研发人员：颜学恒，张智培，薛宜青，苏恩筠，熊延狮，
申请(专利权)人：上海逍鹏生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31