RK‑13细胞HB基因敲除稳定株的构建方法技术

本发明专利技术公开了一种RK‑13细胞HB基因敲除稳定株的构建方法；所述方法包括如下步骤：设计一对互补的靶向家兔HB基因第二个外显子的sgRNA，以pSpCas9(BB)‑2A‑Puro(PX459)V2.0质粒为载体，构建重组真核表达质粒；经测序鉴定后，将重组真核表达质粒共转染进入RK‑13细胞中，使用嘌呤霉素进行阳性细胞筛选，分离单克隆细胞进行培养；用测序鉴定敲除效果。本发明专利技术构建的质粒携带有化脓性链球菌II型CRISPR/Cas9系统的Cas9核酸内切酶基因；CRISPR/Cas9基因编辑技术成功永久性敲除了RK‑13细胞HB基因，获得HB敲除稳定细胞株，为研究HB基因的功能打下坚实基础。

RK 13 cell HB gene knockout method to construct stable strains

The invention discloses a RK 13 cell HB gene knockout strain stable construction method; the method comprises the following steps: Design of a complementary targeting rabbit HB gene second exon sgRNA, pSpCas9 (BB) 2A Puro (PX459) V2.0 plasmid vector, heavy construction eukaryotic expression plasmid; after sequencing, the recombinant eukaryotic expression plasmid were co transfected into RK 13 cells, using puromycin screening positive cells, isolated monoclonal cells were cultured; knockout effect by sequencing. The invention of plasmid carrying Cas9 endonuclease gene of Streptococcus pyogenes II CRISPR/Cas9 system; CRISPR/Cas9 gene editing technology successfully knocked out 13 permanent RK cell HB gene, HB knockdown stable cell line, a solid foundation to study the function of HB gene.

【技术实现步骤摘要】
RK-13细胞HB基因敲除稳定株的构建方法
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种RK-13细胞HB基因敲除稳定株的构建方法。
技术介绍
CRISPR(clustered，regularlyinterspaced，shortpalindromicrepeats)是一种来自细菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制。Cas9蛋白首先与crRNA及tracrRNA结合成复合物，然后通过识别PAM序列(5’-NGG-3’)结合并侵入DNA，然后切割DNA双链，造成碱基的缺失或插入，导致基因沉默。科学家已经利用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑的工作，是新一代的基因定向编辑技术。2011年瑞典女微生物学家EmmanuelleCharpenti在《Nature》上发表论文，阐明了细菌体内的免疫系统Cas9的作用机理，通过这套RNA介导DNA切割机制使细菌免受外源DNA的侵扰并提出了4个关键因素Cas9，crRNA，tracrRNA，以及RNaseIII。随后2012年美国加州大学伯克利分校的科学家JenniferDoudna在《Science》上发表论文，利用这种免疫系统首次实现了基因组的体外编辑，标志着CRISPR的正式诞生。2013年布兰德研究所的华裔科学家张锋联合基因组专家GeorgeChurch共同在《Science》上发表了里程碑式的CRISPR研究成果，首次在哺乳动物细胞上实现基因的定点编辑，标志着该项技术已经走向成熟，为实现技术的应用点定了重要基础。目前该技术已经发展到只需要在细胞内表达Cas9核酸内切酶和相应的sgRNA分子，几乎可以对任意的DNA序列进行切割。此技术的关键点就是设计sgRNA分子，并将其链接到载体中，操作简便。相比于前两代基因打靶技术：锌指核酸内切酶(zincfingerendonuclease，ZFN)和类转录激活因子效应物核酸酶(transcriptionactivator-likeeffectornuclease，TALEN)等经典的基因打靶技术，CRISPR/Cas9基因编辑系统凭借着成本低廉，操作方便，制备周期短，效率高等优点，CRISPR/Cas9迅速风靡全球的实验室，该项技术使基因编辑技术能够在普通的分子实验室进行。在短短的两三年之内，已经成为生物科学领域最炙手可热的研究工具。目前CRISPR/Cas9技术成功应用于人类细胞、斑马鱼和小鼠以及细菌的基因组精确修饰，修饰类型包括基因定点InDe1突变、基因定点敲入、两位点同时突变和小片段的缺失。由于其突变效率高、制作简单及成本低的特点，被认为是一种具有广阔应用前景的基因组定点改造分子工具。血红蛋白β亚基在过去一直认为只是具有携氧能力的蛋白质，在细菌感染过程中能够加快血液运输，进而促进对细菌的清除。已经有文献报道经典猪瘟病毒C蛋白能够与HB相互作用并且能够抑制猪瘟病毒在细胞上的增殖，干扰HB表达病毒滴度上升，我们可以利用敲除的细胞株进行下游实验，。兔出血症病毒属于杯状病毒科兔病毒属，在过去很长一段时间因为没有合适的细胞培养系统，导致该病毒的研究相对其他正链RNA病毒比较落后，无法进行适当的细胞实验，我们实验室通过对RHDV的衣壳蛋白表面氨基酸分子的核苷酸序列进行定点突变，改造后的病毒能够在RK-13细胞上进行增殖，取得了突破进展，这使得我们可以让RHDV在细胞上增值进行下游实验。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种RK-13细胞HB基因敲除稳定株的构建方法；具体是利用改良的CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除RK-13细胞中HB基因，构建RK-13细胞HB基因敲除稳定株。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：本专利技术涉及一种RK-13细胞HB基因敲除稳定株的构建方法，所述方法包括如下步骤：S1、设计一对互补的靶向家兔HB基因第二个外显子的sgRNA，以pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)V2.0质粒为载体，构建出一个重组真核表达质粒；S2、经测序鉴定后，将所述重组真核表达质粒共同转染进入RK-13细胞中，使用嘌呤霉素进行阳性细胞筛选，分离单克隆细胞进行培养；用测序鉴定敲除效果，即可获得RK-13细胞HB基因敲除稳定株。结果：sgRNA正确插入到PX459质粒载体中，转染并筛选单克隆后的细胞中WB验证HB蛋白表达缺失。结论：成功构建出RK-13细胞HB基因敲除稳定株。优选的，步骤S1中，所述sgRNA的序列包括如SEQIDNO.1所示的正向引物HB-sgRNAF序列，和如SEQIDNO.2所示的反向引物HB-sgRNAR序列。优选的，步骤S1中，所述构建具体包括如下步骤：S1-1、利用BbsI限制性内切酶将pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)V2.0质粒进行线性化，并利用碱性磷酸酶孵育，去除酶切后质粒末端序列磷酸化；然后琼脂糖凝胶电泳纯化，回收DNA片段；S1-2、将两条所述sgRNA寡聚核苷酸单链退火形成双链，并经T4激酶磷酸化；退火产物与所述回收的DNA片段利用T4DNA连接酶进行连接，并转化至Stb13感受态细胞中，挑取单克隆菌落；S1-3、用U6启动子作为引物进行测序，提取测序正确质粒。优选的，步骤S1-2中，T4激酶磷酸化的程序为37℃30min，95℃5min，90℃至25℃每分钟下降5℃，4℃保存。本专利技术还涉及一种靶向敲除RK-13细胞HB基因的重组真核表达质粒，所述重组真核表达质粒是通过设计一对互补的靶向家兔HB基因第二个外显子的sgRNA，以pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)V2.0质粒为载体构建而得的重组真核表达质粒。优选的，所述sgRNA的序列包括如SEQIDNO.1所示的正向引物HB-sgRNAF序列，和如SEQIDNO.2所示的反向引物HB-sgRNAR序列。本专利技术具有如下有益效果：本专利技术利用pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)V2.0构建的(PX459-HB)携带有化脓性链球菌II型CRISPR/Cas9系统的Cas9核酸内切酶基因；CRISPR/Cas9基因编辑技术成功永久性的敲除了RK-13细胞HB基因，获得了HB敲除稳定细胞株，为将来研究HB基因的功能打下坚实的基础。附图说明通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本专利技术的其它特征、目的和优点将会变得更明显：图1为两个sgRNA设计合成原则示意图；图2为RK-13细胞和敲除株HB基因组测序结果AB1文件比对示意图；其中，上图为RK-13细胞基因组测序结果AB1文件，下图为敲除株HB基因组测序结果AB1文件；图3为RK-13细胞和敲除株HB基因组测序结果SEQ文件比对示意图；其中，上图为RK-13细胞基因组测序结果SEQ文件，下图为敲除株HB基因组测序结果SEQ文件；图4为WB检测RK-13细胞和敲除株HB基因敲除效果及β-actin对照；其中，左图为RK-13敲除细胞株效果，右图为β-actin对照。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本专利技术，但不以任何形式限制本专利技术。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种RK‑13细胞HB基因敲除稳定株的构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：S1、设计一对互补的靶向家兔HB基因第二个外显子的sgRNA，以pSpCas9(BB)‑2A‑Puro(PX459)V2.0质粒为载体，构建出一个重组真核表达质粒；S2、经测序鉴定后，将所述重组真核表达质粒共同转染进入RK‑13细胞中，使用嘌呤霉素进行阳性细胞筛选，分离单克隆细胞进行培养；用测序鉴定敲除效果，即可获得RK‑13细胞HB基因敲除稳定株。

【技术特征摘要】
1.一种RK-13细胞HB基因敲除稳定株的构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：S1、设计一对互补的靶向家兔HB基因第二个外显子的sgRNA，以pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)V2.0质粒为载体，构建出一个重组真核表达质粒；S2、经测序鉴定后，将所述重组真核表达质粒共同转染进入RK-13细胞中，使用嘌呤霉素进行阳性细胞筛选，分离单克隆细胞进行培养；用测序鉴定敲除效果，即可获得RK-13细胞HB基因敲除稳定株。2.根据权利要求1所述的RK-13细胞HB基因敲除稳定株的构建方法，其特征在于，步骤S1中，所述sgRNA的序列包括如SEQIDNO.1所示的正向引物HB-sgRNAF序列，和如SEQIDNO.2所示的反向引物HB-sgRNAR序列。3.根据权利要求1所述的RK-13细胞HB基因敲除稳定株的构建方法，其特征在于，步骤S1中，所述构建具体包括如下步骤：S1-1、利用BbsI限制性内切酶将pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)V2.0质粒进行线性化，并利用碱性磷酸酶孵育，去除酶切后质粒...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘光清，谭永贵，刘腾，朱杰，陈宗艳，李传锋，
申请(专利权)人：中国农业科学院上海兽医研究所，
类型：发明
国别省市：上海,31