一种聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的纯化方法技术

本发明专利技术涉及一种聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的纯化方法。具体而言，本发明专利技术优化了阳离子交换色谱分离纯化PEG‑G‑CSF，并进行适当的缓冲液置换制备PEG‑G‑CSF原液的方法，通过一步柱层析纯化并置换缓冲液即可获得HPLC、电泳纯度均在98％以上的PEG‑G‑CSF。本发明专利技术纯化工艺不仅简化了工艺路线，节省了生产时间，并且蛋白回收率高，获得的蛋白原液纯度高，加入适当的药用辅料即可制备成药物制剂，十分适合大规模工业化放大生产。

Purification method of polyethylene glycol Recombinant Human Granulocyte Colony-stimulating Factor

The invention relates to a purification method of polyethylene glycol Recombinant Human Granulocyte Colony-stimulating Factor. Specifically, the invention optimizes the cation exchange chromatography separation and purification of PEG G CSF, and buffer replacement method for preparation of PEG G CSF stoste proper, were more than 98% PEG G CSF step column chromatography and buffer exchange can be obtained through HPLC, electrophoresis purity. The invention not only simplifies the purification process route, save production time, and high protein recovery rate, obtained high purity protein solution, adding medicinal materials can be prepared into pharmaceutical preparations, very suitable for large-scale industrial production.

【技术实现步骤摘要】
一种聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的纯化方法
本专利技术涉及高纯度药用蛋白质溶液的纯化领域，具体涉及聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子(Peglylationrecombinanthumangranulocytecolonystimulatingfactor，PEG-G-CSF)修饰产物的纯化，属于医药

技术介绍
近几年来，随着生物技术的突飞猛进，越来越多的蛋白和多肽类药物被发现并成功的应用于人类疾病的治疗。其中，重组人粒细胞集落刺激因子(recombinanthumangranulocytecolonystimulatingfactor，rhG-CSF)是一个非常成功的基因工程药物。G-CSF由单核细胞及成纤维细胞产生，可刺激粒细胞集落形成，对中性粒细胞有刺激作用，因此常用于接受放射治疗或化疗的癌症病人以及骨髓移植后白血病患者的辅助治疗，其序列是公知的，如序列1所示。1991年，Amgen公司的rhG-CSF获得FDA批准上市用于化疗引起的中性粒细胞减少症的治疗，但是，由于蛋白药物自身的特性，该药物在临床上的使用受到了很大的限制，比如较短的体内半衰期、容易受到体内的酶解作用从而被迅速清除出体外、容易产生免疫原和抗原、较低的溶解性等。为了解决这些问题，改善蛋白类药物在人体内的药代动力学，科学家做了很多方面的努力和尝试，目前最成功的技术是聚乙二醇化学修饰技术(Peglylation)。Amgen公司开发的Pegfilgrastin(商品名Neulasta)就是利用聚乙二醇修饰技术，对G-CSF进行了修饰，延长了其体内半衰期，提高生物利用度，从而取得了很好的临床效果，2002年1月和2002年8月，Amgen公司生产的Neulasta分别由美国的FDA和欧洲批准上市，为Amgen公司带来了巨大的经济效益。PEG-G-CSF的纯化需要去除聚乙二醇修饰产物中的过量聚乙二醇(Polyethyleneglycol，PEG)、未交联的G-CSF、二交联甚至多交联的G-CSF，较常采用的分离方法为分子排阻色谱分离配合离子交换分离。虽然分子排阻色谱分离能够去除二交联及多交联的G-CSF，但是由于受上样体积的限制，该方法很难在工业化生产规模使用。因此迫切需要开发一种工艺路线简单、适合工业化放大生产，同时易于控制产品质量的PEG-G-CSF纯化工艺。CN101172161A公开了一种聚乙二醇修饰的G-CSF偶联物，其具有天然人源G-CSF生理活性，而且具有比G-CSF更长的体内循环半衰期和更好的粒细胞刺激因子活性。CN1663962A公开了采用SPSepharoseFF层析柱进行PEG-G-CSF纯化的工艺，该款层析介质平均粒径为90μm，具有流速快，易于放大的优点，但是分辨率较低，获得的PEG-G-CSF纯度低，而SPSepharoseHP作为高分辨率的层析介质平均粒径为34μm，我们曾将SPSepharoseFF层析柱与本专利技术中的SPSepharoseHP层析柱用于PEG-G-CSF纯化的效果进行比较，SPSepharoseHP层析柱的纯化效果明显优于SPSepharoseFF层析柱。CN102234310A公开了一种通过MacroCapSP阳离子层析柱进行聚乙二醇修饰蛋白分离纯化的方法，该方法应用于PEG-G-CSF的分离纯化，选择在pH4.0-5.0过柱，先以一个较低浓度的NaCl(5％～15％的0.5-1.5mol/LNaCl溶液)洗脱多PEG修饰的G-CSF，再以20％-50％的0.5-1.5mol/LNaCl溶液洗脱单修饰的目标峰，一步纯化蛋白纯度只能达到90％，即使再次进行MacroCapSP柱层析纯化，纯度也只能达到95％。
技术实现思路
本专利技术提供了一种聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的纯化方法，包括：将PEG-G-CSF修饰产物上样至阳离子交换层析柱进行层析纯化，先采用缓冲液进行杂质洗脱，再采用缓冲液A液与B液进行线性梯度洗脱，收集样品峰。其中，所述阳离子交换层析柱的层析介质聚合物可以是交联葡聚糖Sephadex、琼脂糖Sepharose、纤维素Cellulose或聚苯乙烯Source，优选SepharoseHP。所述的缓冲液包含1-100mmol/L乙酸-乙酸钠，30-60mmol/LNaCl，pH为3.0-6.0，优选20mmol/L乙酸-乙酸钠，50mmol/LNaCl，pH4.0。所述的缓冲液A液包含1-100mmol/L乙酸-乙酸钠，30-60mmol/LNaCl，pH为3.0-6.0，缓冲液B液包含1-100mmol/L乙酸-乙酸钠，200-300mmol/LNaCl，pH为3.0-6.0，优选缓冲液A液包含20mmol/L乙酸-乙酸钠，50mmol/LNaCl，pH4.0，缓冲液B液包含20mmol/L乙酸-乙酸钠，250mmol/LNaCl，pH4.0。PEG-G-CSF粗品上样于层析柱使用的线性流速可为10-100cm/h，优选为40-50cm/h。上样于层析柱的PEG-G-CSF粗品蛋白量可为每1ml层析介质上样1-10mg蛋白，优选为每1ml层析介质上样2mg蛋白。杂质洗脱使用的线性流速可以是10-100cm/h，优选为50-80cm/h；杂质洗脱液可以是3-5倍柱体积，优选为5倍柱体积。线性梯度洗脱条件可以采用从0％B液到100％B液的线性梯度，梯度体积为10-30倍柱体积，优选15倍柱体积；洗脱使用的线性流速可为10-100cm/h，优选为60-80cm/h，更优选为70cm/h。进一步地，本专利技术的纯化方法还可包括在上样前对PEG-G-CSF修饰产物进行缓冲液置换的步骤。进一步地，本专利技术的纯化方法还可包括将收集得到的纯化样品进行缓冲液置换的步骤。所述的缓冲液置换的方法可以是透析、脱盐柱层析、超滤中的一种或多种，所述超滤可以是中空纤维超滤或膜包超滤；如若采用超滤方式进行缓冲液置换，对于39KD的PEG-G-CSF，超滤膜孔径包括但不限于3KD-30KD，优选5KD或10KD，更优选为10KD；中空纤维超滤使用的中空纤维管内径包括但不限于0.5mm，0.75mm，1mm和1.75mm，更优选为1mm；如若采用GEHealthcare公司的中空纤维柱进行超滤缓冲液置换，剪切速率应控制在16000sec-1以下，更优选为约8000sec-1。如若采用中空纤维超滤进行缓冲液置换，超滤条件可以是：①澄清反应液在超滤系统中适当浓缩；②采用恒体积置换，在超滤系统内保持样品体积恒定，使流加的洗滤液速度与透出液速度相同；③跨膜压力(TMP)不大于50PSI，更优选为20-30PSI；④共超滤置换样品体积的3倍以上，考虑到合理的工艺用时，更优选为5倍体积，即共流加洗滤液体积为置换起始样品体积的3倍以上，更优选为约5倍体积。缓冲液置换所使用的缓冲液包含1-100mmol/L乙酸-乙酸钠，pH3.0-6.0，优选为20mmol/L乙酸-乙酸钠，pH4.0；缓冲液温度控制在2-30℃，更优选为2-8℃。在本专利技术提供的纯化方法中，阳离子交换层析柱在上样前已经过缓冲液平衡，平衡缓冲液可包含1-100mmol/L乙酸-乙酸钠，pH3.0-6.0，优选为20mmol/L乙酸-乙酸钠，pH4.0；层析柱本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的纯化方法，包括：将PEG‑G‑CSF修饰产物上样至Sepharose HP阳离子交换层析柱进行层析纯化，先采用缓冲液进行杂质洗脱，再采用缓冲液A液与B液进行线性梯度洗脱，收集样品峰。

【技术特征摘要】
2016.04.15 CN 20161023810301.一种聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的纯化方法，包括：将PEG-G-CSF修饰产物上样至SepharoseHP阳离子交换层析柱进行层析纯化，先采用缓冲液进行杂质洗脱，再采用缓冲液A液与B液进行线性梯度洗脱，收集样品峰。2.根据权利要求1所述的聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的纯化方法，其特征在于，所述的缓冲液包含1-100mmol/L乙酸-乙酸钠，30-60mmol/LNaCl，pH为3.0-6.0，优选20mmol/L乙酸-乙酸钠，50mmol/LNaCl，pH4.0。3.根据权利要求1所述的聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的纯化方法，其特征在于，所述的缓冲液A液包含1-100mmol/L乙酸-乙酸钠，30-60mmol/LNaCl，pH为3.0-6.0，缓冲液B液包含1-100mmol/L乙酸-乙酸钠，200-300mmol/LNaCl，pH为3.0-6.0，优选缓冲液A液包含20mmol/L乙酸-乙酸钠，50mmol/LNaCl，pH4.0，缓冲液B液包含20mmol/L乙酸-乙酸钠，250mmol/LNaCl，pH4.0。4.根据权利要求1所述的聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的纯化方法，其特征在于所述线性梯度洗脱的梯度体积为10-30倍柱体积，优选15倍柱体积。5.根据权利要求1所述的聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的纯化方法，其特征在于所述杂质洗脱的梯度体积为3-5倍柱体积，优选5倍柱体积。6.根据权利要求1所述的聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的纯化方法，其特征在于，还包括在上样前对PEG-G-CSF修饰产物进行缓冲液置换的步骤。7.根据权利要求1所述的聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的纯化方法，其特征在于，还包括将收集得到的纯化样品进行缓冲液置换的步骤。8.根据权利要求6或7所述的聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的纯化方法，其特征在于，所述缓冲液置换的方法选自透析、脱盐柱层析、超滤中的一种或多种，所述超滤优选中空纤维超滤或膜包超滤。9.根据权利要求8所述的聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的纯化方法，其特征在于，所述中空纤维超滤的超滤膜孔径为3KD-30KD，优选5KD或10KD，更优选为10KD。10.根据权利要求6或7所述的聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的纯化方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：张晨光，王宏伟，孙金星，汪军，王亚里，孔祥林，封海莹，
申请(专利权)人：江苏恒瑞医药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32