一种腐烂茎线虫离体培养方法技术

本发明专利技术公开了一种腐烂茎线虫离体培养方法，包括如下步骤：第一步，培养基上培养镰刀菌（

Method for culturing rotten stem nematode in vitro

The invention discloses a method for culturing decayed stem nematode in vitro, comprising the following steps: firstly, culturing Fusarium on a culture medium;

【技术实现步骤摘要】
一种腐烂茎线虫离体培养方法
本专利技术涉及一种利用真菌培养腐烂茎线虫的方法，属植物病原线虫培养。
技术介绍
腐烂茎线虫（Ditylenchusdestructor）是一种全球重要的植物病原线虫，美国、加拿大、秘鲁、日本、新西兰、南非、荷兰、挪威、俄罗斯、伊朗、澳大利亚等国家和地区分布广泛，危害严重。在我国主要分布于北京、河北、河南、安徽、山东、江苏、甘肃、云南等地。腐烂茎线虫主要危害甘薯和马铃薯。在甘薯上，腐烂茎线虫主要引起甘薯块根糠心、空心和腐烂等症状，一般可导致其减产20%～50%，严重时达80%以上，甚至绝收，在储藏期还可引起烂窖，是威胁我国甘薯生产的重要病害。在马铃薯上，主要造成薯块腐烂,该病害在荷兰、挪威、俄罗斯等国家发生较严重，我国目前只有零星发生。除甘薯和马铃薯外，该线虫还可危害当归、薄荷、三七、黄芪等，严重危害当归时发病率高达80%～90%，是当归生产上最重要的病害。腐烂茎线虫是重要的植物病原线虫，它的寄主范围较广，主要有甘薯、马铃薯、当归、花生、胡萝卜、大豆、烟草、番茄等约90～120多种植物。在国外主要危害马铃薯和花生,在国内主要危害甘薯和中药材，是我国甘薯上最重要的病害之一。该线虫可在甘薯薯块上进行培养，但目前尚缺乏成熟的线虫离体培养技术。在科学研究和实践中，没有足够的材料是开展该线虫生理生化特性、致病机理、遗传特点、药剂筛选以及控制技术等的主要制约因素，因此，研发一种可获得大量、具有良好生命力的线虫群体的培养技术显得尤为重要。
技术实现思路
本专利技术成功实现有效地对腐烂茎线虫离体培养，因而，提供一种腐烂茎线虫离体培养方法，本专利技术根据腐烂茎线虫具有食真菌的习性，有针对性地选择培养该类线虫喜食的、可培养的真菌，采用马铃薯蔗糖琼脂（PDA）培养基培养真菌，然后利用真菌菌丝培养腐烂茎线虫，以解决该类线虫可控制、可持续培养的问题。本专利技术提供的技术方案是：一种腐烂茎线虫离体培养方法，包括如下步骤：第一步，培养基上培养镰刀菌（Fusariumspp.），待其长出菌丝体后；第二步，将马铃薯腐烂茎线虫培养于所述长有菌丝的培养基中。所述的培养方法，其中，第一步所述培养基为马铃薯蔗糖琼脂（PDA）培养基；第二步所述线虫制备成悬浮液后再养于所述长有菌丝的培养基中。所述的培养方法，其中第一步所述培养镰刀菌是在培养皿上进行，待菌丝长满培养皿后，用于培养所述线虫。所述的培养方法，其中第二步中将线虫悬浮液均匀地分布于长满菌丝的培养基中，将培养容器用封口膜封好，将正置于25℃下暗培养。所述的培养方法，优选地，所述接种量为1000条/皿（培养皿直径90mm）。所述的培养方法，优选地，正置培养2～4d后将培养皿盖朝下放置，继续培养25-35后，即可收集到大量的线虫。所述的培养方法，优选地，第二步中，所述线虫从病薯中分离。所述的培养方法，第二步中，线虫悬浮液的具体制备方法如下：在漏斗上连一乳胶管，乳胶管的另一头连一指形管，将漏斗放在漏斗架上，漏斗内放一铁丝网，网上铺两层餐巾纸；将采集到的病薯用自来水冲洗干净，用刀切小块，轻轻放在纸上，从餐巾纸背面加入适量无菌水，使水漫过病害组织；24h后取下指型管，静置1-2min后，弃去上层水；然后用玻璃吸管将分离到的线虫转移至2mL离心管中；加入35%的蔗糖溶液后，以3000r/min离心2min；取表层线虫悬浮液，转移至无菌水中，以3000r/min离心2min，弃上清液；然后用0.5%次氯酸钠消毒2min后，移入0.5%青霉素和0.5%硫酸链霉素混合液中消毒10min，离心后吸出消毒液，用无菌水冲洗3遍后4℃保存备用。本专利技术具有以下有益效果：1、本专利技术根据腐烂茎线虫具有食真菌的习性，有针对性地选择培养该类线虫喜食的、可培养的真菌，采用马铃薯蔗糖琼脂（PDA）培养基培养真菌，然后利用真菌菌丝培养腐烂茎线虫，以解决该类线虫可控制、可持续培养的问题，本专利技术可用于离体繁殖大量研究用腐烂茎线虫，也可用于腐烂茎线虫的保存。2、本专利技术使用的镰刀菌生长迅速、容易培养，是较理想的线虫培养基质。培养得到的线虫纯度高、生活力强。具体实施方式本专利技术利用真菌培养腐烂茎线虫的方法，其具体操作步骤如下：一、PDA培养基的制作：称取洗净、去皮的马铃薯薯块200g，切碎后加水1000mL煮沸半小时，用纱布滤去薯块，加入葡糖糖15g，琼脂15g，加水补足1000mL，加热使琼脂熔化。分装在三角瓶中，加塞后在121℃下灭菌20分钟。当培养基温度降至45℃左右时，分装至直径9cm培养皿，每皿培养基10-15mL。二、镰刀菌的培养将分离、纯化得到的镰刀菌（Fusariumspp.）或保存的镰刀菌菌种在超净工作台上接种至PDA平板培养基上，25℃培养恒温培养。待菌丝长满培养皿后，在超净工作台上用无菌的打孔器打取镰刀菌菌饼，用无菌的接种针或镊子将菌饼接入PDA培养基上，置于25℃下恒温培养。三、线虫悬浮液的制备：在漏斗上连一乳胶管，乳胶管的另一头连一指形管，将漏斗放在漏斗架上，漏斗内放一铁丝网，网上铺两层餐巾纸。将采集到的病薯用自来水冲洗干净，用刀切小块，轻轻放在纸上，从餐巾纸背面加入适量无菌水，使水漫过病害组织。24h后取下指型管，静置1-2min后，弃去上层水。然后用玻璃吸管将分离到的线虫转移至2mL离心管中。加入35%的蔗糖溶液后，以3000r/min离心2min；取表层线虫悬浮液，转移至无菌水中，以3000r/min离心2min，弃上清液。然后用0.5%次氯酸钠消毒2min后，移入0.5%青霉素和0.5%硫酸链霉素混合液中消毒10min，离心后吸出消毒液，用无菌水冲洗3遍后4℃保存备用。四、茎线虫的接种和培养待菌丝长满整个培养皿（一周左右）后，用移液枪将线虫悬浮液均匀地分布于长满菌丝的培养基中，接种量为1000条/皿（培养皿直径90mm），将培养皿用封口膜封好，将培养皿正置，于25℃下暗培养。培养2～3d后将培养皿盖朝下放置。继续培养30d后，即可收集到大量的线虫。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种腐烂茎线虫离体培养方法，其特征在于，包括如下步骤：第一步，培养基上培养镰刀菌（

【技术特征摘要】
1.一种腐烂茎线虫离体培养方法，其特征在于，包括如下步骤：第一步，培养基上培养镰刀菌（Fusariumspp.），待其长出菌丝体后；第二步，将腐烂茎线虫培养于所述长有菌丝的培养基中。2.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，第一步所述培养基为蔗糖琼脂（PDA）培养基。3.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，其中第二步所述线虫制备成悬浮液后再养于所述长有菌丝的培养基中。4.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，其中第一步所述培养镰刀菌是在培养皿上进行，待菌丝长汇培养皿后，用于培养所述线虫。5.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，第二步中将线虫悬浮液均匀地分布于长满菌丝的培养基中，将培养容器用封口膜封好，将正置于25℃下暗培养。6.如权利要求5所述的培养方法，其特征在于，所述接种量为1000条/皿，培养皿直径90mm。7.如权利要求5所述的培养方法，其特征在于，正置培养2～4d后将培养皿盖...

【专利技术属性】
技术研发人员：李惠霞，徐鹏刚，刘永刚，李敏权，刘霞霞，
申请(专利权)人：甘肃农业大学，
类型：发明
国别省市：甘肃,62