一种CD3ε×CD19双特异性纳米抗体及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种CD3ε×CD19双特异性纳米抗体。所述双特异性纳米抗体，其特征在于：所述双特异性纳米抗体包含3部分，a）一种抗CD19的纳米抗体，针对肿瘤细胞表面抗原具有特异性结合能力，优选的该肿瘤细胞表面抗原是CD19，CD20，CD30和CD133，更优选地，是该肿瘤细胞表面抗原是CD19；b）一种抗CD3ε纳米抗体，针对的免疫细胞选自T细胞，NKT细胞或者CIK细胞，优选的，对免疫细胞表面抗原CD3具有特异性结合能力；c）连接短肽，连接两种纳米抗体。本发明专利技术还提供了一种制备双特异性纳米抗体的方法以及双特异性纳米抗体的检测方法。所述双特异性纳米抗体在制备药物中的用途，所述的药物用于治疗CD19特异性表达所引起的肿瘤，或者特异性杀伤表达CD19的细胞。

A CD3 * CD19 nano bispecific antibody and its preparation method

The invention provides a CD3 e * CD19 bispecific antibody nanoparticles. The bispecific antibody nanoparticles, which is characterized in that the bispecific antibody nanoparticle consists of 3 parts, a) a nano anti CD19 antibody, the tumor cell surface antigen has a specific binding ability, the tumor cell surface antigen is preferably CD19, CD20, CD30 and CD133, more preferably, the tumor cell surface antigen CD19; b) an anti CD3 antibody against the epsilon nano, immune cells from T cells, NKT cells or CIK cells, preferably, has on the immune cell surface antigen CD3 specific binding capacity; c) connecting peptide, connected with the two kinds of nano antibody. The invention also provides a method for preparing a bispecific antibody and detection method for nano bispecific antibody nanoparticles. The bispecific antibody nano use in preparation of medicine, medicine for the treatment of specific expression of CD19 caused by the tumor, or specific killing cells expressing CD19.

【技术实现步骤摘要】
一种CD3ε×CD19双特异性纳米抗体及其制备方法
本专利技术涉及免疫
，具体的涉及一种双特异性纳米抗体的制备方法以及双特异性纳米抗体。
技术介绍
双特异性抗体是含有两种特异性抗原结合位点的人工抗体，能在靶细胞和功能分子(细胞)之间架起桥梁，激发具有导向性的免疫反应，是基因工程抗体的一种，现已成为抗体工程领域的热点，在肿瘤的免疫治疗中具有广阔的应用前景。其特点是双特异性抗体能够同时结合肿瘤相关抗原和免疫效应细胞上的靶分子，直接触发免疫效应细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤。纳米抗体是存在于驼类外周血里面的天然缺失轻链的重链抗体的的可变区片段。是目前已知的能够结合抗原的最小结构单位。纳米抗体具有免疫原性低、分子量小，可溶性高的优点。目前国内还没有针对肿瘤治疗的双特异性纳米抗体药物的临床治疗数据。以下针对所研究的免疫效应细胞抗原和肿瘤细胞抗原做简单介绍，并介绍相关
技术介绍
的发展。1.CD3在免疫学中，CD3分子由四个不同的亚基组成。分别是γ，δ，ε，ζ。CD3仅存在于T细胞表面，由6条肽链组成，常与TCR紧密结合形成含有8条肽链的TCR-CD3复合体。，具体示意图见图一。CD3胞质段含免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptortyrosine-basedactivationmotif,ITAM)，TCR识别并结合由MHC(majorhisto-compatibilitycomplex)分子提呈的抗原肽，导致CD3的ITAM的保守序列的酪氨酸残基被T细胞内的酪氨酸蛋白激酶p56lck磷酸化，然后可募集其他含有SH2(Scrhomology2)结构域的酪氨酸蛋白激酶(如ZAP-70)。ITAM的磷酸化和与ZAP-70的结合是T细胞活化信号传导过程早期阶段的重要生化反应之一。因此，CD3分子的功能是转导TCR识别抗原所产生的活化信号。CD3ε或γ链基因缺陷可致T细胞信号传导缺陷。2.CD19CD19表达于B系细胞(不包括成熟浆细胞)及滤泡树突状细胞上，CD19是一种重要的信号传导分子，调节B淋巴细胞的生长激活和活化，在调节B淋巴细胞抗原受体或其他表面受体的信号阈值中起重要作用，是与B淋巴细胞分化、活化、增殖及抗体产生有关的重要膜抗原，是诊断B淋巴细胞系肿瘤和鉴定B淋巴细胞的最好标志。3.双特异性抗体制备方法制备双特异抗体有化学偶联法、杂交瘤方法和基因工程方法等三种方法。化学偶联法可快速、大量制备双特异抗体,但这种双特异抗体用于体内时易被清除,影响其应用；杂交瘤方法制备的双特异抗体生物活性高,但制备时要经过融合、筛选等繁琐的步骤,耗时长,所得双特异抗体不易与同时产生的其它单抗分离；基因工程方法制备的双特异抗体分子量小,易于大量制备,具有广阔的应用前景。
技术实现思路
术语和缩略语：VHH：重链可变区RNA：核糖核苷酸cDNA：互补脱氧核糖核酸PCR：聚合酶链反应NanoBiTE:双特异性纳米抗体Tumorcell:肿瘤细胞Tcell：T细胞PBMC：外周血单个核细胞本专利技术提供了一种双特异性纳米抗体，针对常规单克隆抗体或者单克隆纳米抗体的缺点以及人工改造的双克隆抗体的缺点进行研发的双特异性纳米抗体，所述的双特异性纳米抗体具有稳定性高，可溶性好，抗原结合力强的特点。该双特异性纳米抗体通过介导特异性T细胞杀伤作用，大大提高了肿瘤的杀伤功效。具体地，本专利技术提供了以下的技术方案：在一种实施方式中，一种双特异性纳米抗体，其特征在于：所述双特异性纳米抗体包含3部分，a)一种抗CD19的纳米抗体，针对肿瘤细胞表面抗原具有特异性结合能力，优选的该肿瘤细胞表面抗原是CD19，CD20，CD30和CD133，更优选地，是该肿瘤细胞表面抗原是CD19；b)一种抗CD3ε纳米抗体，针对的免疫细胞选自T细胞，NKT细胞或者CIK细胞，优选的，对免疫细胞表面抗原CD3具有特异性结合能力；c)连接短肽，连接两种纳米抗体。在一种实施方式中，所述双特异性纳米抗体取自驼类体内。在一种实施方式中，所述双特异性纳米抗体是抗人源抗原的抗体。在一种实施方式中，所述的双特异性纳米抗体的连接短肽序列为GGGGSGGGGSGGGGS。在一种实施方式中，所述的抗CD19的纳米抗体的氨基酸序列是序列号1所示的序列。在一种实施方式中，所述的抗CD3的纳米抗体的氨基酸序列是序列号2所示的序列。在一种实施方式中，所述的双特异性纳米抗体的制备方法包括如下步骤：1)羊驼外周血单个核细胞(PBMC)的分离的过程2)流式细胞分选抗体阳性克隆的过程3)提取阳性细胞RNA,反转录成cDNA的过程4)抗人CD3ε和CD19纳米抗体序列的扩增过程5)CD3εVHH－CD19VHH双特异性抗体原核表达载体的构建鉴定过程6)pet32a-CD3εVHH-CD19VHH的原核表达及鉴定过程在一种实施方式中，所述的双特异性纳米抗体的制备方法中，所用的连接载体是pet32a(+)。在一种实施方式中，所述的双特异性纳米抗体的制备方法中，把两个纳米抗体连接起来的方法是重叠PCR方法。在一种实施方式中，所述的双特异性纳米抗体或者按照权利要求7制备双特异性纳米抗体的方法制备的双特异性纳米抗体在制备药物中的用途，所述的药物用于治疗CD19特异性表达所引起的肿瘤，或者特异性杀伤表达CD19的细胞。本专利技术的技术方案的有益效果有：1本专利技术提供了一种双特异性纳米抗体以及制备方法，相对于现有的双特异性抗体来说，其分子量小，可溶性好，高表达性以及高抗原结合特性。2本专利技术结合流式细胞分选技术加高通量筛选的方法来制备双特异性纳米抗体，制作周期短，抗体得率高。附图说明图1.CD3分子结构示意图。图2.双特异性纳米抗体作用机制示意图。图3.第一步CD3ε片段获得1.阴性对照；2.CD3ε第一步PCR扩增；3.DL2000marker图4.第一步CD19片段获得4.阴性对照；5，6.CD19第一步PCR扩增；7.DL2000marker图5.第二步CD3ε和CD19片段获得7.空白对照；8.DL2000Marker；9.CD3ε第二步PCR扩增；10.CD19第二步PCR扩增。图6.CD3εVHH与CD19你VHH的琼脂糖凝胶电泳11.CD3ε-VHH与CD19-VHH的连接产物12.DL2000DNAMarker13.阴性对照图7.pET32a-CD3εVHH-CD19VHH重组载体的构建14.DL2000DNAMarker15.pET32a-CD3εVHH-CD19VHH的PCR扩增产物16.阴性对照图8.pET32a-CD3εVHH-CD19VHH重组蛋白的获得17.蛋白分子量Marker18.pET32a-CD3εVHH-CD19VHH诱导表达19.菌液对照图9.CD3ε蛋白与双特异性纳米抗体的结合趋势图图10.CD19蛋白与双特异性纳米抗体的结合趋势图具体实施方式实施例1.羊驼外周血单个核细胞(PBMC)的分离的过程整个实验过程无菌操作：1.用CD3ε和CD19免疫羊驼后，使用15mL的离心管进行采血，将血液带回实验室后直接将离心管放入离心机中离心，整个过程室温即可。根据血液样本量确定离心条件，血液样本量越多，离心力越大，离心时间越长。2.吸取上层血清，血清800μL每管分装标记，保存在-80℃冰箱备用。3本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种双特异性纳米抗体，其特征在于：所述双特异性纳米抗体包含3部分，a）一种抗CD19的纳米抗体，针对肿瘤细胞表面抗原具有特异性结合能力，优选的该肿瘤细胞表面抗原是CD19，CD20，CD30和CD133，更优选地，是该肿瘤细胞表面抗原是CD19；b）一种抗CD3ε纳米抗体，针对的免疫细胞选自T细胞，NKT细胞或者CIK细胞，优选的，对免疫细胞表面抗原CD3具有特异性结合能力；c）连接短肽，连接两种纳米抗体。

【技术特征摘要】
1.一种双特异性纳米抗体，其特征在于：所述双特异性纳米抗体包含3部分，a）一种抗CD19的纳米抗体，针对肿瘤细胞表面抗原具有特异性结合能力，优选的该肿瘤细胞表面抗原是CD19，CD20，CD30和CD133，更优选地，是该肿瘤细胞表面抗原是CD19；b）一种抗CD3ε纳米抗体，针对的免疫细胞选自T细胞，NKT细胞或者CIK细胞，优选的，对免疫细胞表面抗原CD3具有特异性结合能力；c）连接短肽，连接两种纳米抗体。2.根据权利要求1所述的双特异性纳米抗体，其特征在于：所述的双特异性纳米抗体取自驼类体内。3.根据权利要求1所述的双特异性纳米抗体，其特征在于：所述双特异性纳米抗体是人源抗原的抗体。4.根据权利要求1所述的双特异性纳米抗体，其特征在于：所述连接短肽的序列为GGGGSGGGGSGGGGS。5.根据权利要求1所述的双特异性纳米抗体，其特征在于：所述的抗CD19的纳米抗体的氨基酸序列是序列号1所示的序列。6.根据权利要求1所述的双特异性纳米抗体，其特征在于：所述的抗CD3的纳米抗体的氨基酸序列是序列号2所示的序列。7.制备权利要求1-6中任一项所述的双特异性纳米抗体的方法：其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：李洪利，李福胜，林兆新，凌志，庄文超，毕全庆，覃海兰，
申请(专利权)人：康众北京生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11