本发明专利技术属于动物传染病防治技术领域，具体涉及一种乙型脑炎病毒的保护性单克隆抗体及其抗原位点的应用。制备得到一种由保藏编号为CCTCC NO：201699的JEV NS1杂交瘤细胞株2B8分泌的对乙型脑炎病毒NS1蛋白的保护性单克隆抗体。所述的单克隆抗体能识别NS1蛋白中的225位WPETHTLWGD234位的氨基酸片段，该片段的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。本发明专利技术还公开了一种对乙型脑炎病毒NS1蛋白具有保护作用的多肽，该多肽的氨基酸序列为WPETHTLWGD。生物功能验证表明本发明专利技术的单克隆抗体可在制备治疗和预防乙型脑炎病毒疫苗中的应用。
Protective monoclonal antibody of Japanese encephalitis virus and application of its antigen site
The invention belongs to the field of animal infectious disease prevention and control technology, in particular to a protective monoclonal antibody of Japanese encephalitis virus and the application of its antigen site. Preparation of protective monoclonal antibody a number CCTCC NO:201699 JEV NS1 hybridoma cell strain 2B8 secreted by the preservation of Japanese encephalitis virus NS1 protein. The monoclonal antibody can recognize NS1 protein in 225 WPETHTLWGD234 amino acid fragment, amino acid sequence of this fragment is shown in a sequence table SEQ ID NO:1. The invention also discloses a polypeptide which has protective function against the Japanese encephalitis virus NS1 protein, and the amino acid sequence of the polypeptide is WPETHTLWGD. Biological function tests show that the monoclonal antibodies of the present invention can be used in the preparation, treatment and prevention of Japanese encephalitis virus vaccines.
【技术实现步骤摘要】
一种乙型脑炎病毒的保护性单克隆抗体及其抗原位点的应用
本专利技术属于动物传染病防治
，具体涉及一种针对乙型脑炎病毒NS1蛋白的保护性单克隆抗体及其对应抗原位点的应用
技术介绍
乙型脑炎病毒不仅引起人的中枢神经系统疾病，还可引起猪的繁殖障碍性疾病，是一种重要的人畜共患传染病病原。乙型脑炎病毒主要侵入神经系统，包括丘脑，基底神经节，脑干，小脑，大脑皮层和脊髓，导致严重的中枢神经系统疾病，例如脊髓灰质炎样严重瘫痪，无菌性脑膜炎和脑炎，71％的患者都是基底神经节和丘脑损伤，严重出现运动障碍，43％患者脑干损伤，经常出现急性呼吸衰竭症状，甚至死亡。患者的病死率与临床症状高达10％～50％，而且大约一半乙型脑炎病毒感染幸存者都有严重的神经后遗症。在亚洲每年大约50,000乙脑病例中就有15,000例死亡。2006年7月山西发生日本乙型脑炎流行，共60多人发病，其中19人死亡，造成了较大的社会影响。目前已应用的乙型脑炎病毒疫苗为弱毒疫苗和灭活疫苗。其中灭活疫苗是世界卫生组织推荐的在全球应用的疫苗，虽然该疫苗具有较高的安全性，但是在免疫保护力上却不够理想，经常出现免疫失败的报道。乙型脑炎病毒弱毒疫苗由我国自行研制，该疫苗具有较高的免疫保护效率，但是由于安全性不够高，目前仅在我国使用，同时儿童是我国乙型脑炎病毒的主要免疫人群，考虑到安全性问题，儿童使用的疫苗仍以灭活疫苗为主。因此开发兼具高保护力和高安全性的乙型脑炎疫苗具有重要的意义。更为重要的是，目前尚没有针对乙型脑炎病毒的治疗技术，导致了该病的死亡率高，即使康复造成的后遗症也高。乙型脑炎病毒编码两个重要的免疫保护蛋白，分别为囊膜蛋白(E)和非结构蛋白1(NS1)。E蛋白为结构蛋白，免疫后可以诱生中和抗体，为机体提供保护作用。NS1蛋白为非结构蛋白，在体内也具有很高的抗原性，诱导产生的抗体在细胞中没有中和活性，但是在动物体内却具有比结构蛋白E更高的免疫保护效率。研究发现，针对E蛋白的中和抗体可在体内起到治疗作用，然而针对乙型脑炎病毒NS1蛋白开发的治疗技术尚未有报道。通过筛选针对NS1蛋白的保护性单克隆抗体，应用于乙型脑炎的治疗，则具有较高的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的缺陷，其目的之一是提供一种能够对乙型脑炎病毒有特异性的单克隆抗体。本专利技术的目的之二是提供一种能够对乙型脑炎病毒起到保护作用的氨基酸序列。本专利技术通过筛选得到了一株在动物体内对乙型脑炎病毒具有免疫保护功能的单克隆抗体，并对抗原位点进行了鉴定，得到一个具有较好免疫保护活性的抗原位点，具有较高的应用前景。本专利技术通过如下技术方案实现：申请人通过制备得到一株分泌乙型脑炎病毒NS1蛋白具有保护性作用单克隆抗体的JEVNS1单克隆抗体杂交瘤细胞株2B8，于2016年5月16日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏编号为CCTCCNO：201699。将所述的单克隆抗体的通过静脉注射小白鼠后，可起到很好的治疗效果。所述的单克隆抗体能识别NS1蛋白中的225WPETHTLWGD234氨基酸片段，该片段的氨基酸序列如序列表SEQIDNO：1所示。本专利技术中所述具有保护作用的多肽序列为WPETHTLWGD(其氨基酸序列见序列表SEQIDNO:1所示)，经过鉴定其中的T、H、L、W氨基酸为关键氨基酸。本专利技术得到具有保护作用的多肽序列，可用于多肽疫苗、核酸疫苗、亚单位疫苗以及基因工程多价疫苗的开发。本专利技术的多肽序列可通过合成产生，也可以通过基因工程表达获得。本专利技术的有益效果如下：1.本专利技术将NS1的单克隆抗体用于乙型脑炎病毒的治疗，目前仍未有基于乙型脑炎病毒NS1治疗的方法，本专利技术为乙型脑炎的治疗提供了一种新方法。2.本专利技术制备的单克隆抗体可通过杂交瘤细胞分泌，也可以通过基因工程改造成人源或者猪源基因工程抗体，具有很强的适用性。3.本专利技术的保护性抗原表位可用于多种疫苗的开发，针对性强，可构建具有更高免疫保护效果的疫苗。4.NS1蛋白在乙型脑炎病毒中提供的保护力达到100％，且针对NS1的抗体不会产生抗体依赖性增强作用，针对NS1的治疗效果比针对结构蛋白效果更理想。附图说明：序列表SEQIDNO：1是本专利技术制备的多肽序列；序列长度为10个氨基酸。图1：是本专利技术的总体技术路线图。图2：本专利技术中NS1基因的PCR扩增得到的跑胶图。附图标记说明：图2中的Lane1是NS1基因的PCR产物，图2中的Lane2为DNAmarker。图3：本专利技术中使用的原核表达载体pET28a质粒图谱。图4.本专利技术中表达并纯化的乙型脑炎病毒NS1蛋白。附图标记说明：Lane1为表达纯化的NS1蛋白，Lane2为蛋白质marker。图5.本专利技术制备的单克隆抗体2B8与乙型脑炎病毒反应的间接免疫荧光鉴定。附图标记说明：图5A是用乙型脑炎病毒感染的细胞，可发现呈现明亮的阳性反应；图5B是未用乙型脑炎病毒感染的对照，呈阴性结果。图6：本专利技术制备的单克隆抗体2B8与乙型脑炎病毒NS1蛋白的Westernblot鉴定。附图标记说明：Lane1显示单克隆抗体2B8可与NS1蛋白形成明显的杂交斑点，Lane2为对照组与2B8单抗无反应，说明抗体特异性良好。图7：NS1的分段表达策略。附图标记说明：图7中左边一列A-I的字母代表对不同NS1片段的命名，右边一列的数字代表该片段在NS1蛋白中的位置。图8：不同片段的NS1与2B8单抗的反应性。附图标记说明：图8中的上方Anti-His或2B8代表分别用不同的抗体与蛋白反应；A-I字母标识代表图7中所述的不同NS1蛋白片段。图9：单个氨基酸位点的突变蛋白与2B8单抗的反应原性。附图标记说明：图9A中为不同氨基酸突变的NS1蛋白与His抗体的反应性；图9B为不同氨基酸突变的NS1蛋白与2B8单抗的反应性。泳道1为未突变蛋白对照，2-7分别对应于表2中的Ka、Kb、La、Lb、Ma、Mb的突变。图10：本专利技术制备的单克隆抗体对乙型脑炎病毒攻击的保护力试验结果。附图标记说明：用不同的单克隆抗体注射被乙型脑炎病毒感染的小白鼠，本专利技术的单克隆抗体2B8可达到80％的保护力，而本实验室制备的其它针对NS1的单抗则为0-20％之间。说明本专利技术制备的单克隆抗体2B8具有很好的治疗效果。图11：多肽免疫保护的试验结果。具体实施方式：以下通过实施例来进一步描述本专利技术，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，但不限制本专利技术的使用范围。实施例1乙型脑炎病毒NS1蛋白抗原的制备1)抗原的克隆表达以乙脑病毒NS1基因(GenBank登录号U47032.1)为模板，用引物Forward：GCAGAATTCGACACTGGATGTGCCATTG，Reverse：CAGAAGCTTGAGCATCAACCTGTGATCTAA进行目的片段的扩增。扩增体系如下：TaqDNA聚合酶1uL、10×TaqBuffer5uL、模板1uL、Forward引物1uL、Reverse引物1uL、dNTP2uL、H2O39uL。扩增条件如下：95度变性5分钟，然后进入循环：94度30秒、55度30秒、72度1分钟，反应35个循环后，72度延伸10分钟。PCR产物用1％琼脂糖凝胶回收，酶切回收后连入到载体pET-28a(图3)构建重本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种由保藏编号为CCTCC NO：201699的JEV NS1杂交瘤细胞株2B8分泌的对乙型脑炎病毒NS1蛋白的保护性单克隆抗体。
【技术特征摘要】
1.一种由保藏编号为CCTCCNO：201699的JEVNS1杂交瘤细胞株2B8分泌的对乙型脑炎病毒NS1蛋白的保护性单克隆抗体。2.权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体能识别NS1蛋白中的225WPETHTLW...
【专利技术属性】
技术研发人员：宋云峰，裴超，周登元，刘朝霞，曹胜波，邵彦春，陈焕春，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42
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