一种脱细胞胶原凝胶微球支架的制备方法及应用技术

本发明专利技术提供一种脱细胞胶原凝胶微球支架的制备方法，属于脱细胞支架组织工程技术领域。所述方法包括细胞‑胶原混合液的制备，细胞‑胶原凝胶微球的制备以及脱细胞胶原微球支架的制备。本发明专利技术通过直接制备包裹细胞的胶原凝胶微球，在体外培养得到微米级组织块，在快速得到大量微米级组织的同时，可以直接进行脱细胞操作，避免后续的破碎过程，更好的保留了组织中的基质以及微细结构。本发明专利技术脱细胞胶原凝胶微球支架无DNA残留，可以将排斥反应降到最低。本发明专利技术脱细胞胶原凝胶微球支架尺寸为微米级别，将其应用于软骨及软骨下骨缺损修复，有利于细胞的粘附及组织愈合，后期形成均匀分布的组织，避免空心化，减少手术创伤和后期感染的概率。

Preparation method of acellular collagen gel microsphere stent and application thereof

The invention provides a preparation method of a acellular collagen gel microsphere stent, belonging to the technical field of acellular scaffold tissue engineering. The method comprises the cell collagen mixture preparation, cell collagen gel microspheres and preparation of acellular collagen microspheres scaffold preparation. The invention of collagen gel microspheres by direct preparation of encapsulated cells cultured from micron tissue in vitro, quickly get a large number of micron in the organization at the same time, can be directly off the cell operation, avoid the crushing process of follow-up, better retention of tissue matrix and fine structure. The acellular collagen gel microsphere has no DNA residue and can minimize rejection. The invention of acellular collagen gel microsphere scaffold size in micron level, which will be used in the repair of cartilage and subchondral bone defect, is beneficial to the adhesion and tissue healing, formed homogeneous structure, avoid hollowing, reducing the probability of surgical trauma and late infection.

【技术实现步骤摘要】
一种脱细胞胶原凝胶微球支架的制备方法及应用
本专利技术属于脱细胞支架组织工程
，具体为一种脱细胞胶原凝胶微球支架的制备方法及应用。
技术介绍
脱细胞支架是常见的组织工程支架。脱细胞支架的来源主要有天然组织和体外组织工程。但是都存在一些问题。由于来源问题，人源天然组织比较少见。大多采用异种来源，猪眼角膜，牛心包等产品都非常常见。但是，异种来源的组织，更加容易出现排斥反应。体外组织工程也可以获得满足一定功能的组织，比如脂肪、软骨、骨，相比天然来源更加容易获得和大批量生产。脱细胞是制备脱细胞支架最关键的一步，细胞的脱除和基质以及生物因子的保存都非常重要。过分脱细胞，会导致基质和因子被破坏，无法保留脱细胞支架的生物学性能。细胞脱除不干净，残余的DNA等物质会导致排斥反应。常见的手段，就是将天然组织或者组织工程获得的组织破碎成小块，再进行脱细胞处理。破碎过程的发热和机械力会导致包括生物因子的基质和微细结构变性或者被破坏。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种脱细胞胶原凝胶微球支架的制备方法，通过直接制备包裹细胞的胶原凝胶微球，在体外培养得到微米级的组织块。在快速得到大量微米级组织的同时，能避免后续的破碎过程，可以直接进行脱细胞操作，更好的保留了组织中的基质以及微细结构。本专利技术目的通过下述技术方案来实现：一种脱细胞胶原凝胶微球支架的制备方法，包括细胞-胶原混合液的制备，细胞-胶原凝胶微球的制备以及脱细胞胶原凝胶微球支架的制备。作为本专利技术一种脱细胞胶原凝胶微球支架的制备方法的一个具体实施例，所述细胞-胶原混合液的制备为：将胶原溶液pH调节至6.5～7.5，并将细胞悬液均匀混合到胶原溶液中即得细胞-胶原混合液；所述细胞-胶原凝胶微球的制备为：将细胞-胶原混合液加入到油相溶液中，生成稳定悬浮液后，提供合适的成胶条件使微球凝胶化，然后经离心或过滤收集、清洗后即得细胞-胶原凝胶微球。作为本专利技术一种脱细胞胶原凝胶微球支架的制备方法的一个具体实施例，所述脱细胞胶原凝胶微球支架的制备为：将上述制备的细胞-胶原凝胶微球在体外培养后收集所需的胶原凝胶微球，在液氮及水中反复冷冻-溶解1～10次，经清洗Ⅰ、震荡Ⅰ后将胶原凝胶微球加入到DNAse1的水溶液中震荡1～24h，最后经清洗Ⅱ、戊二醛处理及培养基清洗即得脱细胞胶原凝胶微球支架。本步骤中将DNAse1的处理时间设定为1～24h小时，是因为当处理时间大于24小时会对基质造成很大的破坏。作为本专利技术一种脱细胞胶原凝胶微球支架的制备方法的一个具体实施例，所述戊二醛处理后还包括酒精浸泡及超声处理，最后再用培养基清洗。作为本专利技术一种脱细胞胶原凝胶微球支架的制备方法的一个具体实施例，所述液氮及水中反复冷冻-溶解前还包括用加有蛋白酶抑制剂的去离子水将凝胶微球清洗1～6次。作为本专利技术一种脱细胞胶原凝胶微球支架的制备方法的一个具体实施例，所述水的温度为25～37℃；所述清洗Ⅰ为用0.1％～2％的TritonX-100水溶液中清洗1～3次；所述震荡Ⅰ为在100～1000rpm转速下震荡1～60min。作为本专利技术一种脱细胞胶原凝胶微球支架的制备方法的一个具体实施例，所述DNAse1的水溶液中DNAse1的浓度为10～500units/mL；所述DNAse1的水溶液中震荡温度为20～37℃，转速为10～140rpm，并间隔0.5～12h更换一次新鲜DNAse1溶液，每次更换DNAse1溶液前用0.05％～2％的TritonX-100水溶液清洗0～5min。作为本专利技术一种脱细胞胶原凝胶微球支架的制备方法的一个具体实施例，所述清洗Ⅱ为采用EDTA溶液清洗0～10次；所述戊二醛处理为采用0.1％戊二醛处理0～24小时；所述酒精浸泡为采用用75％酒精浸泡0～1小时；所述超声处理时间为0～10min。本专利技术还提供一种脱细胞胶原凝胶微球支架，所述胶原凝胶微球支架采用上述制备方法制备得到。本专利技术还提供所述脱细胞胶原凝胶微球支架的应用，所述脱细胞凝胶微球支架在软骨及软骨下骨缺损修复中的应用。本专利技术的有益效果：本专利技术通过直接制备包裹细胞的胶原凝胶微球，在体外培养得到微米级的组织块。在快速得到大量微米级组织的同时，可以直接进行脱细胞操作，避免后续的破碎过程，更好的保留了组织中的基质以及微细结构。本专利技术制备的脱细胞胶原凝胶微球支架无DNA残留，可以将排斥反应降到最低。本专利技术还提供所述脱细胞胶原凝胶微球支架的应用，将其应用于软骨及软骨下骨缺损修复。本专利技术脱细胞胶原凝胶微球支架尺寸为微米级别，将其应用于软骨及软骨下骨缺损修复，有利于细胞的粘附及组织愈合，有利于后期形成均匀分布的组织，避免空心化现象，可以在关节镜下操作减少手术创伤和后期感染的概率。附图说明图1为本专利技术脱细胞胶原凝胶微球支架制备方法的流程图。图2为实施例1制备的骨髓间充质干细胞-胶原凝胶微球在软骨诱导培养基中培养5天、10天和15天的细胞状态；图3为骨髓间充质干细胞-胶原凝胶微球脱细胞前后的DAPI染色，其中(a)表示脱细胞前，(b)表示脱细胞后；图4为脱细胞前后骨髓间充质干细胞-胶原凝胶微球的TB染色，其中(a)表示脱细胞前，(b)表示脱细胞后；图5为脱细胞胶原凝胶微球支架种植骨髓间充质干细胞得到的块状组织；图6为脱细胞胶原凝胶微球支架种植骨髓间充质干细胞得到组织的FDA染色；图7为脱细胞胶原凝胶微球支架种植骨髓间充质干细胞得到组织的TB染色；图8为在关节软骨修复时，植入脱细胞胶原凝胶微球支架的操作示意图；图9为对比例四种脱细胞流程处理方式得到的脱细胞支架样品DAPI染色。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。实施例1按以下步骤制备装载骨髓间充质干细胞的胶原凝胶微球1、取浓度为15mg/mL的胶原溶液，在冰水浴中用少量1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH到7.0，稀释胶原溶液到8mg/mL；2、将提前准备好的骨髓间充质干细胞，计数并且用α-MEM培养基制备成细胞悬液，加入到胶原溶液中并分散均匀，胶原终浓度为6.5mg/mL，细胞密度为5×106个/mL；3、选择粘度为100mPa·s的甲基硅油70mL，加入0.05％(v/v)的Span-80，用磁力搅拌器以500rpm的转速搅拌；4、在冰水浴条件下，将细胞-胶原混合液滴加到油相中，继续搅拌30分钟；然后将水相-油相混合体系升温至37度，继续搅拌20分钟；搅拌完成后，将水相-油相混合液离心，将底层沉淀分散到α-MEM培养基中清洗；5、将上述含有胶原微球的α-MEM培养基经过40微米筛网过滤，用培养基冲洗3次即得本实施例骨髓间充质干细胞-胶原凝胶微球。实施例2按以下步骤制备装载软骨细胞的胶原凝胶微球1、取浓度为15mg/mL的胶原溶液，在冰水浴中用少量1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH到7.0，稀释胶原溶液到8mg/mL；2、将提前准备好的软骨细胞，计数并且用α-MEM培养基制备成细胞悬液，加入到胶原溶液中并分散均匀，胶原终浓度为5mg/mL，细胞密度为1×107个/mL；3、选择粘度为100mPa·s的甲基硅油70mL，加入0.1％(v/v)的Span-80，用磁力本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种脱细胞胶原凝胶微球支架的制备方法，其特征在于，包括细胞‑胶原混合液的制备，细胞‑胶原凝胶微球的制备以及脱细胞胶原凝胶微球支架的制备。

【技术特征摘要】
1.一种脱细胞胶原凝胶微球支架的制备方法，其特征在于，包括细胞-胶原混合液的制备，细胞-胶原凝胶微球的制备以及脱细胞胶原凝胶微球支架的制备。2.如权利要求1所述一种脱细胞胶原凝胶微球支架的制备方法，其特征在于，所述细胞-胶原混合液的制备为：将胶原溶液pH调节至6.5～7.5，并将细胞悬液均匀混合到胶原溶液中即得细胞-胶原混合液；所述细胞-胶原凝胶微球的制备为：将细胞-胶原混合液加入到油相溶液中，生成稳定悬浮液后，提供合适的成胶条件使微球凝胶化，然后经离心或过滤收集、清洗后即得细胞-胶原凝胶微球。3.如权利要求1所述一种脱细胞胶原凝胶微球支架的制备方法，其特征在于，所述脱细胞胶原凝胶微球支架的制备为：将上述制备的细胞-胶原凝胶微球在体外培养后收集所需的胶原凝胶微球，在液氮及水中反复冷冻-溶解1～10次，经清洗Ⅰ、震荡Ⅰ后将胶原凝胶微球加入到DNAse1的水溶液中震荡1～24h，最后经清洗Ⅱ、戊二醛处理及培养基清洗即得脱细胞胶原凝胶微球支架。4.如权利要求3所述一种脱细胞胶原凝胶微球支架的制备方法，其特征在于，所述戊二醛处理后还包括酒精浸泡及超声处理，最后再用培养基清洗。5.如权利要求3所述一种脱细胞胶原凝胶微球支架的制备方法，其特征在于，所述液氮及水中反复冷冻-溶解前还包括用加有蛋白酶抑制剂的去...

【专利技术属性】
技术研发人员：樊渝江，刘钧，林海，王启光，孙勇，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：四川,51