一种沙丁胺醇免疫磁珠分离富集试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术涉及了一种沙丁胺醇免疫磁珠分离富集试剂盒。包括偶联沙丁胺醇单克隆抗体的磁珠、复溶液和磁铁，偶联沙丁胺醇单克隆抗体的磁珠是由沙丁胺醇单克隆抗体与磁珠的质量比为1：500～600混合并溶于2-(N-吗啉代)乙磺酸一水合物中偶联制备而成，沙丁胺醇单克隆抗体是由沙丁胺醇半抗原与牛血清白蛋白得到的偶联物作为免疫原免疫Balb/c小鼠制备获得，沙丁胺醇半抗原是由沙丁胺醇与氨基苯甲酸经重氮化反应，在酚羟基旁边引入带羧基间隔臂得到的。本发明专利技术还涉及一种采用所述的沙丁胺醇免疫磁珠分离富集试剂盒分离沙丁胺醇的样品前处理方法，本方法对沙丁胺醇具有较高的特异性，回收率和准确度，简化样品前处理步骤，避免样品前处理过程中使用多种和大量的有机溶剂。

【技术实现步骤摘要】
一种沙丁胺醇免疫磁珠分离富集试剂盒及其应用
本专利技术涉及一种沙丁胺醇免疫磁珠试剂盒及其对样品中沙丁胺醇的分离富集方法。属于免疫学领域。
技术介绍
沙丁胺醇(Salbutamol,SAL)，又名舒喘灵，为选择性β-受体激动剂，能选择性激动支气管平滑肌的β-受体，有较强的支气管扩张作用。用于预防支气管哮喘。实验证实SAL能够促进动物骨骼肌生长，减少脂肪蓄积。人食用含沙丁胺醇较高的动物组织后会出现肌肉颤动、肌痛、头痛、恶心、呕吐等中毒症状。在盐酸克仑特罗的非法使用受到了极大限制后，不法分子不得不寻找新的替代品，如沙丁胺醇、西马特罗等。因而，国内外有部分养殖场非法使用本类药物。我国农业部发布的《食品动物禁用的兽药及其它化合物清单》明确规定沙丁胺醇等β-兴奋剂被禁止所有用途，禁用所有食品动物。目前，对于沙丁胺醇的残留检测主要有高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用分析法、气相色谱-质谱法、毛细管区带电泳法等方法。由于上述检测方法的样品前处理均需要使用净化装置，包括C18柱、石墨化碳固相萃取柱、弗罗里硅土固相萃取柱、硅胶SPE固相萃取柱等。上述固相萃取柱价格昂贵，约为500-2000元/支，且净化步骤繁琐，需要多种有机溶剂。沙丁胺醇免疫磁珠分离技术由于内含Fe3O4的纳米磁珠的表面修饰官能团可与沙丁胺醇特异性单克隆抗体结合构成沙丁胺醇免疫磁珠，通过外加磁场利用抗体的特异性免疫反应从混合溶液中富集和分离沙丁胺醇，沙丁胺醇免疫磁珠的净化载体为分散状，可提高特异性单克隆抗体与检测靶物质的结合概率，从而提高样品中沙丁胺醇的回收率，增加了沙丁胺醇检测方法的准确度。免疫磁珠的磁珠与抗体之间的结合键为化学结合键，结合程度较为牢固；免疫亲和柱是利用抗原和抗体的特异性结合性质的特殊的SPE小柱。抗体与载体存在的共价键为疏水作用力及离子交换作用力等物理结合力，其结合力度没有免疫磁珠的化学结合键的结合力度大。而且免疫亲和柱的载体为固相，抗体与检测靶物质的结合概率与免疫磁珠相比较会低。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种沙丁胺醇免疫磁珠分离富集试剂盒，采用该试剂盒进行样品中沙丁胺醇的分离富集时具有较高的特异性、回收率和准确度，简化样品前处理步骤，避免样品前处理过程中使用多种和大量的有机溶剂。为实现上述目的，本专利技术提供一种沙丁胺醇免疫磁珠分离富集试剂盒，其包括偶联沙丁胺醇单克隆抗体的磁珠、复溶液和磁铁，所述偶联沙丁胺醇单克隆抗体的磁珠是由沙丁胺醇单克隆抗体与磁珠的质量比为1：500～600混合并溶于2-(N-吗啉代)乙磺酸一水合物中偶联制备而成，所述沙丁胺醇单克隆抗体是由沙丁胺醇半抗原与牛血清白蛋白得到的偶联物作为免疫原免疫Balb/c小鼠制备获得。所述沙丁胺醇半抗原是由沙丁胺醇与氨基苯甲酸经重氮化反应，在酚羟基旁边引入带羧基间隔臂得到的，沙丁胺醇半抗原得率为87％，其结构式如式Ⅰ所示。所述复溶液含有0.2％牛血清白蛋白、0.04％吐温-20以及0.02％NaN3的磷酸盐缓冲液或pH7.4的三羟甲基氨基甲烷缓冲液，所述百分含量均为质量百分含量，所述偶联沙丁胺醇单克隆抗体的磁珠在复溶液中保存。所述磁铁产生外加磁场，使偶联沙丁胺醇单克隆抗体的磁珠聚集在磁铁上，达到分离磁珠的目的。本专利技术还提供了分离富集样品中沙丁胺醇的方法，包括下列步骤：1)用试剂盒进行样品中沙丁胺醇的分离富集；2)将富集有沙丁胺醇的偶联沙丁胺醇单克隆抗体的磁珠用甲醇洗脱，回收甲醇液，用于检测分析。本专利技术的有益效果如下：1)本专利技术试剂盒的具有较高的特异性和准确性，对沙丁胺醇的捕获浓度可达到20ng/mg(每毫克免疫磁珠可以捕获20ng沙丁胺醇)，样品添加回收率≥85％；2)本专利技术试剂盒中的偶联沙丁胺醇单克隆抗体的磁珠与液体经磁力作用容易快速分离开来，分离过程简单，可省去离心和过滤等繁琐的操作过程，节约时间，在撤去外加磁场时，磁珠无磁性记忆，能够均匀分散，不出现聚集现象；3)磁珠具有一定的机械度和化学稳定性，能耐受一定浓度的酸碱溶液和微生物的降解，其结构内的磁性物质不易被氧化，磁性微粒的这种物理化学性质稳定特点，使其磁性不易下降；4)磁珠的润洗和洗脱分别用去离子水和甲醇，0.1mL的偶联沙丁胺醇单克隆抗体的磁珠只需1mL甲醇洗脱即可，所用试剂的量较少，磁珠的润洗和洗脱过程较环保。附图说明图1为沙丁胺醇半抗原合成反应式。图2为沙丁胺醇半抗原核磁共振氢谱图。具体实施方式实施例1：试剂盒具体组分的制备1.沙丁胺醇半抗原合成沙丁胺醇半抗原是由沙丁胺醇与对氨基苯甲酸经重氮化反应，在酚羟基旁边引入带羧基的间隔臂，得到沙丁胺醇半抗原。取0.5g对氨基苯甲酸，加入到300μL1mol/L的盐酸溶液中，再加入4mL蒸馏水稀释，冷却至0℃并搅拌，加入0.23g，继续搅拌2h，得到重氮盐溶液。取0.7g沙丁胺醇，用甲醇溶解，向其中加入0.21g氢氧化钠，搅拌，加入重氮盐溶液，继续搅拌4h，停止反应，加入稀盐酸调节pH值至5.0，加乙酸乙酯萃取，分去水相，将有机相蒸干，加入乙醚重结晶得到沙丁胺醇半抗原产物0.61g，收率为87％。合成反应式如图1所示。取上述半抗原产物经核磁氢谱测定，如图2所示，化学位移δ＝11ppm的位置为羧基氢，化学位移δ＝8.21～8.41的位置为苯甲酸上苯环的氢，这些特征峰的存在证明偶联成功，半抗原结构正确。核磁鉴定结果：1HNMR(CDCl3,300MHZ)δ:11.0(s,1H,COOH),8.21-8.41(d,4H,ArH),7.39(s,1H,ArH),7.75(s,1H,ArH),5.35(s,1H,OH),4.87(t,1H,-CH-),4.67(d,2H,CH2),3.65(s,1H,-OH),3.15(d,2H,-CH2),2.0(s,1H,-NH),1.27(d,9H,-CH3)。2.免疫原的制备取9mg沙丁胺醇半抗原，溶解于1mLN,N-二甲基甲酰胺(DMF)中；取30mg二氯乙烷(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)用0.2mL水充分溶解后，加入半抗原溶液中，室温下搅拌24h，即可得到反应液A；称取牛血清白蛋白(BSA)50mL，使之充分溶解在3.8mLpH值为7.2的磷酸盐缓冲液中，将反应液A逐滴缓慢滴加到BSA溶液中，并于室温下搅拌24h；用0.01mol/L的磷酸盐缓冲液于4℃透析3天，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质，得到沙丁胺醇免疫原；分装，于-20℃保存备用。3.沙丁胺醇单克隆抗体的制备1)动物免疫：用上述制备出的免疫原(RAC-BSA)按100μg/只，以生理盐水溶解免疫原与弗氏完全佐剂等体积混匀，颈背部皮下注射免疫6～8周龄Balb/c雌鼠，初次免疫后第7、14、28天以免疫原与弗氏不完全佐剂等体积混匀，各追加免疫一次，融合前3天以免疫复合物100μg/只，不加弗氏佐剂再追加免疫一次。2)细胞融合：按常规方法进行，取免疫小鼠的脾细胞与处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)混合，然后在45秒内缓慢加入预热的融合剂(PEG4000)进行融合，用HAT培养基悬浮均匀，再加入适量的饲养细胞，培养于96孔培养板，于37℃，5％CO2培养箱中培养，5天后用HT培养基半换液，9天时候进行全换液。3)杂交瘤细胞的筛选：本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种沙丁胺醇免疫磁珠分离富集试剂盒，其特征在于包括偶联沙丁胺醇单克隆抗体的磁珠、复溶液和磁铁，所述偶联沙丁胺醇单克隆抗体的磁珠是由沙丁胺醇单克隆抗体与磁珠的质量比为1：500～600混合并溶于2‑(N‑吗啉代)乙磺酸一水合物中偶联制备而成，所述沙丁胺醇单克隆抗体是由沙丁胺醇半抗原与牛血清白蛋白得到的偶联物作为免疫原免疫Balb/c小鼠制备获得。

【技术特征摘要】
1.一种沙丁胺醇免疫磁珠分离富集试剂盒，其特征在于包括偶联沙丁胺醇单克隆抗体的磁珠、复溶液和磁铁，所述偶联沙丁胺醇单克隆抗体的磁珠是由沙丁胺醇单克隆抗体与磁珠的质量比为1：500～600混合并溶于2-(N-吗啉代)乙磺酸一水合物中偶联制备而成，所述沙丁胺醇单克隆抗体是由沙丁胺醇半抗原与牛血清白蛋白得到的偶联物作为免疫原免疫Balb/c小鼠制备获得。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述沙丁胺醇半抗原是由沙丁胺醇与氨基苯甲酸经重氮化反应，在酚羟基旁边引入带羧基间隔臂得到的，沙丁胺醇半抗原得率为87％，其结构式如式Ⅰ所示。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗晓琴，朱亮亮，刘玉梅，冯月君，赵正苗，王琳琛，徐念琴，
申请(专利权)人：北京勤邦生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11