人表皮生长因子受体Her-2/neu定量检测试剂盒及其制备方法与应用技术

技术编号:15789703 阅读:30 留言:0更新日期:2017-07-09 17:39
本发明专利技术提供了一种人表皮生长因子受体Her-2/neu定量检测试剂盒及其制备方法与应用。本发明专利技术的试剂盒是基于磁微粒化学发光法制备而成,其中采用重组的Her-2/neu抗原作为标准品抗原,并稀释至含非离子表面活性剂的蛋白缓冲组分中,增加其分散性,防止自身凝集,保持活性;另将Her-2/neu蛋白抗体和磁微粒偶联,采用优化的固定化方法和封闭方法,使磁分离组分稳定性良好;此外采用多组分免疫复合物和罗氏主动型干扰去除蛋白MAK33联用,可解决肿瘤标志物夹心法检测中异嗜性抗体干扰的问题,提高了终产品的特异性。本发明专利技术的试剂盒性能优异,成本较低,同时有效期长。

【技术实现步骤摘要】
人表皮生长因子受体Her-2/neu定量检测试剂盒及其制备方法与应用
本专利技术属于医药生物类免疫检测试剂领域,具体涉及一种人表皮生长因子受体Her-2/neu定量检测试剂盒及其制备方法与应用,更具体地说,是涉及一种基于磁微粒分离化学发光法定量检测肿瘤标志物人表皮生长因子受体Her-2/neu的试剂盒及其制备方法,以及应用该试剂盒定量检测肿瘤标志物人表皮生长因子受体Her-2/neu的方法。
技术介绍
人表皮生长因子受体Her-2/neu基因是一种最初在化学物质诱发的大鼠神经母细胞瘤和胶质母细胞瘤的DNA中被发现的原癌基因,也称为c-erB2,其由922个腺嘌呤、1,382个胞嘧啶、1,346个鸟嘌呤和880个胸腺嘧啶组成,位于人染色体17q21上,编码相对分子量为185kDa的跨膜糖蛋白(p185),由1255个氨基酸组成,720-987位属于酪氨酸激酶区。Her-2/neu蛋白是具有酪氨酸蛋白激酶活性跨膜糖蛋白,是EGFR家族成员之一。Her-2/neu基因属于一种胞内具有酪氨酸激酶活性的细胞表面受体家族,且结构上与表皮生长因子受体相关(erbB-1)。Her-2/neu蛋白由胞外的配体结合区、单链跨膜区及胞内的蛋白酪氨酸激酶区三部分组成,由于目前尚未发现能与Her-2/neu蛋白直接结合的配体。其主要通过与家族中其他成员包括EGFR(HERl/erbBI),HER3/erbB3,HER4/erbB4形成异二聚体而与各自的配体结合。Her-2/neu蛋白常为异二聚体首选伴侣,且活性常强于其它异二聚体。当与配体结合后,主要通过引起受体二聚化及胞浆内酪氨酸激酶区的自身磷酸化。激活酪氨酸激酶的活性。Her-2/neu蛋白介导的信号转导途径主要有Ras/Raf/分裂素活化蛋白激酶(MAPK)途径,磷脂酰肌醇3羟基激酶(P13K)/Akt途径,信号转导及转录激活(STAT)途径和PLC通路等。2Her-2/neu蛋白在胃癌中的表达情况及影响因素Her-2/neu蛋白通常只在胎儿时期表达,成年以后只在极少数组织内低水平表达。然而在多种人类肿瘤中却过度表达,如乳腺癌、卵巢癌、肺腺癌、原发性。肾细胞癌、子宫内膜癌等,并提示预后不良。在胃癌细胞上Her-2/neu蛋白主要定位在细胞膜上,少量表达在细胞质中。在胃癌中,常见Her-2/neu基因扩增和RNA及蛋白质的过度表达,但在所有非胃癌组织中均检测不到,表明Her-2/neu蛋白在胃癌的发生、发展和侵袭性转移性上发挥着重要作用。HER2癌基因的致瘤机制是抑制凋亡,促进增殖;增加肿瘤细胞的侵袭力;促进肿瘤血管新生和淋巴管新生。HER2基因扩增是影响乳腺癌生长与转移的最重要的因素之一。在大约30%的乳腺癌中可出现HER2基因过度表达,并与患者预后较差相关。HER2过度表达的乳腺癌患者病情进展迅速,化疗缓解期短,内分泌治疗效果差,无病生存和总生存率低。HER2的含量可作为一个独立的强有力的预后指标,尤其对那些腋窝淋巴结阳性的乳腺癌患者它甚至比目前常用的一些肿瘤指标更有说服力。HER2扩增阳性的乳腺癌具有一些特殊的生物学和临床特征,例如组织学分级更差、低ER、PR水平、更多的非整倍体、更倾向于转移至中枢神经系统和内脏、内分泌治疗无效、肿瘤的增殖指数更高、对阿霉素敏感等。目前把HER2基因扩增状态作为乳腺癌药物治疗(环磷酰胺、阿霉素、5-氟尿嘧啶和赫赛汀)的主要参考指标。由于只有HER2过度表达和基因扩增的乳腺癌患者用赫赛汀治疗才有效,因此正确检测和评定乳腺癌的HER2基因扩增状态至关重要。FDA批准了赫赛汀和拉帕替尼两种针对HER2扩增的肿瘤的靶向药物。赫赛汀主要通过阻断HER2/Src相互作用、引起HER2受体下调和促进抗体介导的细胞毒作用而达到治疗肿瘤的目的。HER2基因扩增阳性的转移性乳腺癌中,25%的患者单药治疗有效,并且与其他化疗药联合应用具有协同作用,与阿霉素、环磷酰胺、紫杉醇联合应用可显著延长患者无病生存期和总生存期。在ER和HER2均阳性的患者中,赫赛汀和激素联合治疗有效。HER2蛋白通常只在胎儿时期表达,成年以后只在极少数组织内低水平表达。然而有研究表明30%以上的人类肿瘤中存在HER2基因的扩增/过度表达(如乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、输卵管癌、胃癌和前列腺癌等);其中20%-30%的原发性浸润性乳腺癌有HER2基因的扩增/过度表达。研究证实:HER2的过度表达与肿瘤的发生和侵袭有关,可提高转移的危险;转染的细胞和动物模型证实,其可改变肿瘤对激素和化疗药物的敏感性。目前在乳腺癌中p185已经被认为是一个预后因子、预测因子和治疗的靶蛋白。关于HER2的血清学检测意义:细胞表面HER2蛋白胞外段会受蛋白酶裂解脱落进入血液循环,循环中有HER-2蛋白的胞外段的存在为血清学检测HER2提供了可能。目前检测血清HER2的方法有:酶联免疫分析(EIA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、化学发光免疫分析法等。近期发现的NIDS快速反应法则有待进一步研究。近来研究表明,血清学与组织学HER2的检测结果一致性较好,约有20%-30%乳腺癌患者血清中可溶性HER2蛋白水平升高。血清HER2可作为反映肿瘤生长、复发或者转移的检测指标。高血清HER2水平提示肿瘤的高侵袭性,与临床分期、病情进展、无瘤生存期和总生存期有关,并能监测化疗药的治疗效果,是重要的预后因素。通过检测血清中HER2的水平,有助于诊断、预测患者组织HER2的状态,在接受化疗的晚期乳腺癌患者中监测血清HER2含量有助于预测疗效、无病生存期和总生存期。在指导靶向药物应用方面,血清HER2的检测也可以作为组织学检测的一个补充,并可能使靶向治疗的适应人群得以放宽。血清HER2的检测也可以作为重要的预后因素,可在乳腺癌随访监测、疗效观察尤其是靶向治疗后的疗效观察中发挥其独到的作用。综上所述,HER2与乳腺癌的关系涉及到肿瘤的发生、发展、诊断与鉴别诊断、治疗和预后评价等方面,目前的研究取得一定进展,使乳腺癌的诊治上了一个新台阶。因此,有待开发对人表皮生长因子受体Her-2/neu检测灵敏度高与可靠性并能降低检测成本的检测技术。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于针对上述现有技术检测人表皮生长因子受体Her-2/neu所存在的问题,提供一种新的可定量检测人表皮生长因子受体Her-2/neu的试剂盒,提高检测灵敏度及可靠性,并降低成本,延长有效期。本专利技术的另一目的在于提供制备人表皮生长因子受体Her-2/neu定量检测试剂盒的方法。本专利技术的另一目的在于提供利用所述的试剂盒检测人表皮生长因子受体Her-2/neu的方法。一方面,本专利技术提供了一种人表皮生长因子受体Her-2/neu定量检测试剂盒,该试剂盒包括以下试剂组分:校准品、磁分离试剂、酶反应物、稳定增强剂以及化学发光底物;其中:所述校准品是按照以下方法配制得到的:将人表皮生长因子受体Her-2/neu抗原溶解于含非离子表面活性剂的蛋白缓冲液中配制得到校准品;其中,所述非离子表面活性剂选自Tween20、TritonX100、Bronidox中的一种或多种,非离子表面活性剂在蛋白缓冲液中的浓度为0.01%~0.5%;所述磁分离试剂是按照以下方法制备得到的:将链霉亲和本文档来自技高网
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人表皮生长因子受体Her-2/neu定量检测试剂盒及其制备方法与应用

【技术保护点】
一种人表皮生长因子受体Her‑2/neu定量检测试剂盒,该试剂盒包括以下试剂组分:校准品、磁分离试剂、酶反应物、稳定增强剂以及化学发光底物;其中:所述校准品是按照以下方法配制得到的:将人表皮生长因子受体Her‑2/neu抗原溶解于含非离子表面活性剂的蛋白缓冲液中配制得到校准品;其中,所述非离子表面活性剂选自Tween 20、Triton X 100、Bronidox中的一种或多种,非离子表面活性剂在蛋白缓冲液中的浓度为0.01%~0.5%;所述磁分离试剂是按照以下方法制备得到的:将链霉亲和素和磁微粒偶联制得链霉亲和素磁微粒,利用长臂生物素标记人表皮生长因子受体Her‑2/neu捕获抗体制得生物素化抗体,然后将生物素化抗体与链霉亲和素磁微粒免疫固定,制得磁分离试剂;所述酶反应物包括碱性磷酸酶标记的人表皮生长因子受体Her‑2/neu示踪抗体;所述稳定增强剂包括MAK33和抗异嗜性抗体干扰的多组分免疫复合物,所述MAK33在稳定增强剂中的终浓度为80~120μg/ml;所述多组分免疫复合物是按照以下方法制备得到的:新生牛血清、小鼠血清、绵羊血清按1:1.5~2.5:0.4~0.6的体积比混合,加入硫酸铵沉淀过夜,离心,去上清,将沉淀溶于含0.5%牛血清白蛋白的PBS pH7.2缓冲液中,70~75℃放置0.5~2小时,干燥,制得抗异嗜性抗体干扰的多组分免疫复合物;所述化学发光底物为经缓冲液稀释的APS‑5化学发光底物。...

【技术特征摘要】
1.一种人表皮生长因子受体Her-2/neu定量检测试剂盒,该试剂盒包括以下试剂组分:校准品、磁分离试剂、酶反应物、稳定增强剂以及化学发光底物;其中:所述校准品是按照以下方法配制得到的:将人表皮生长因子受体Her-2/neu抗原溶解于含非离子表面活性剂的蛋白缓冲液中配制得到校准品;其中,所述非离子表面活性剂选自Tween20、TritonX100、Bronidox中的一种或多种,非离子表面活性剂在蛋白缓冲液中的浓度为0.01%~0.5%;所述磁分离试剂是按照以下方法制备得到的:将链霉亲和素和磁微粒偶联制得链霉亲和素磁微粒,利用长臂生物素标记人表皮生长因子受体Her-2/neu捕获抗体制得生物素化抗体,然后将生物素化抗体与链霉亲和素磁微粒免疫固定,制得磁分离试剂;所述酶反应物包括碱性磷酸酶标记的人表皮生长因子受体Her-2/neu示踪抗体;所述稳定增强剂包括MAK33和抗异嗜性抗体干扰的多组分免疫复合物,所述MAK33在稳定增强剂中的终浓度为80~120μg/ml;所述多组分免疫复合物是按照以下方法制备得到的:新生牛血清、小鼠血清、绵羊血清按1:1.5~2.5:0.4~0.6的体积比混合,加入硫酸铵沉淀过夜,离心,去上清,将沉淀溶于含0.5%牛血清白蛋白的PBSpH7.2缓冲液中,70~75℃放置0.5~2小时,干燥,制得抗异嗜性抗体干扰的多组分免疫复合物;所述化学发光底物为经缓冲液稀释的APS-5化学发光底物。2.根据权利要求1所述的人表皮生长因子受体Her-2/neu定量检测试剂盒,该试剂盒还包括质控品,该质控品是按照以下方法配制得到的:将人表皮生长因子受体Her-2/neu抗原稀释至含非离子表面活性剂的蛋白缓冲液中配制得到质控品;其中,所述非离子表面活性剂选自Tween20、TritonX100、Bronidox中的一种或多种,非离子表面活性剂在蛋白缓冲液中的浓度为0.01%~0.5%。3.根据权利要求1或2所述的人表皮生长因子受体Her-2/neu定量检测试剂盒,其中,所述校准品是按照以下方法配制得到的:将人表皮生长因子受体Her-2/neu抗原溶解于PBSpH7.2缓冲液中至0.5mg/ml,15分钟后,加入终浓度为1mM赖氨酸反应5~120分钟;将上述反应物,按不同浓度用含非离子表面活性剂的PBS蛋白缓冲液稀释成不同浓度点,并定标,得到校准品;所述含非离子表面活性剂的PBS蛋白缓冲液组分为:磷酸二氢钠50mM,氯化钠75mM,Tween200.02%,TritonX1000.03%,蔗糖1%,酪蛋白0.15%,牛血清白蛋白3%,Proclin3000.02%,氢氧化钠pH6.8。4.根据权利要求1或2所述的人表皮生长因子受体Her-2/neu定量检测试剂盒,其中,所述磁分离试剂是按照以下方法制备得到的:取磁微粒,加入MES缓冲液中,加入sulfo-NHS、EDC,反应,之后去上清,洗涤;加入人表皮生长因子受体Her-2/neu包被抗体反应过夜,备用;加入含BSA、蔗糖、聚乙二醇6000的PBSpH7.2缓冲液,将磁微粒浓缩液置于平皿中,封闭;用pH6.0缓冲液洗涤数次;用含酪蛋白、牛血清白蛋白、Tween20、Proclin300的PBSpH7.2缓冲液复溶;制得磁分离试剂。5.根据权利要求1或2所述的人表皮生长因子受体Her-2/neu定量检测试剂盒,其中,所述酶反应物是按照以下方法配制得到的:碱性磷酸酶标记人表皮生长因子受体Her-2/neu示踪抗体:将...

【专利技术属性】
技术研发人员:刘劲
申请(专利权)人:北京大成生物工程有限公司
类型:发明
国别省市:北京,11

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