鳍藻毒素快速酶联免疫检测试剂盒及其制法制造技术

本发明专利技术公开了一种鳍藻毒素快速酶联免疫检测试剂盒另外还包括其制法。试剂盒包括96孔酶标板可拆卸条板、酶标记二抗、含吐温-20的缓冲盐洗液、底物液和终止液， 96孔酶标板上包被有蛋白偶联物的完全抗原，并加入抗鳍藻毒素的单克隆抗体。本技术发明专利技术利用抗鳍藻毒素的单克隆抗体研制的间接竞争酶联免疫分析鳍藻毒素的试剂盒，价格比同类进口试剂盒便宜10倍以上，而且灵敏度可达0.6ng/ml。

【技术实现步骤摘要】
鳍藻毒素快速酶联免疫检测试剂盒及其制法
本专利技术涉及一种利用抗鳍藻毒素的单克隆抗体与鳍藻毒素抗原结合，而分析检测环境样品中鳍藻毒素含量的快速检测试剂盒。
技术介绍
鳍藻毒素是我国近岸海域常见的赤潮毒素组分之一，在近岸海域贝类体内常可检出，已严重影响了贝类出口贸易，引起了各级政府及研究领域的极大关注。建立鳍藻毒素的快速灵敏准确的检测方法和产品，对确保海产品食用安全和维持水产养殖经济健康可持续发展具有十分重要的意义。目前已知有腹泻性贝毒检测试剂盒，主要检测腹泻性贝毒组分为软海绵酸，检测灵敏度为0.1ng/mL。而且同类产品多为进口产品，价格比较贵。
技术实现思路
为了解决快速、灵敏分析大批量环境样品中的鳍藻毒素的问题，本技术专利技术提供一种利用抗鳍藻毒素的单克隆抗体研制的间接竞争酶联免疫分析鳍藻毒素的试剂盒。本专利技术的技术方案是这样实现的：鳍藻毒素快速酶联免疫检测试剂盒，包括96孔酶标板可拆卸条板、酶标记二抗、含吐温-20的缓冲盐洗液、底物液和终止液，96孔酶标板上包被有蛋白偶联物的完全抗原，并加入抗鳍藻毒素的单克隆抗体。制法为：将半抗原的腹泻性贝毒主要成分OA与蛋白偶联，合成完全抗原，将获得的完全抗原免疫小鼠，待小鼠血清滴度达到预期后，将小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合，获得抗鳍藻毒素（DTX1和DTX2）的单克隆阳性细胞株，扩大培养后，注入小鼠腹腔诱生腹水，将获得的腹水纯化后，制得抗鳍藻毒素的单克隆抗体，用合成的完全抗原包被96孔酶标板，加入DTX标准品或样品，再加入抗鳍藻毒素的单克隆抗体，包被抗原OA与自由的DTX竞争抗体Mab-DTX，自由的DTX和抗体复合物被洗去，与包被抗原OA结合的抗体Mab-DTX再与酶标记的二抗结合，经底物显色，终止反应，用酶标仪测定各孔的吸光值(OD)，OD值越大，样品中自由的DTX含量越少，对照标准品回归的方程，计算样品DTX的含量。本技术专利技术利用抗鳍藻毒素的单克隆抗体研制的间接竞争酶联免疫分析鳍藻毒素的试剂盒，价格比同类进口试剂盒便宜10倍以上，而且灵敏度可达0.6ng/ml。具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利技术作进一步解释说明。鳍藻毒素快速酶联免疫检测试剂盒，包括96孔酶标板可拆卸条板、酶标记二抗、含吐温-20的缓冲盐洗液、底物液和终止液，96孔酶标板上包被有蛋白偶联物的完全抗原，并加入抗鳍藻毒素的单克隆抗体。具体制法为：将半抗原的腹泻性贝毒主要成分OA溶于少量二甲亚砜中，加入EDC和NHC，25℃反应1.5h后，加入溶解于磷酸缓冲液的（PBS,pH7.0）的血蓝蛋白（KLH），25℃反应3h。将反应混合物移入透析卡中，对PBS透析3d，4℃，每12h换液1次，透析结束后，将透析物分装，获得完全抗原OA-KLH，OA与卵清蛋白(OVA)的偶联方法同OA-KLH，可获得OA-OVA。将制备得到OA-KLH和OA-OVA-20℃保存备用。将获得的完全抗原OA-KLH免疫6-8周龄的雌性Balb/c小鼠，免疫6次后次后杀鼠取脾，将脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合，经HAT选择性培养，获得分泌抗鳍藻毒素（DTX）的单克隆阳性细胞株。制备抗鳍藻毒素（DTX）单克隆抗体；分泌抗鳍藻毒素（DTX）单克隆抗体的杂交瘤细胞株。取8周龄健康Balb/C雌性小鼠或杂交一代鼠，腹腔注射液体石蜡0.5ml/每只，待用。1500r/min离心收集对数生长期的阳性杂交瘤细胞，悬浮于生理盐水中，浓度为106/ml。在石蜡油处理的小鼠腹腔内注射0.5ml杂交瘤细胞悬液诱生腹水，收集腹水，3000r/min离心10min，收集上清液即为含单克隆抗体腹水。腹水用优化的辛酸硫酸氨纯化方法得到粗制抗体蛋白，再用蛋白G亲和柱纯化，制得抗鳍藻毒素的单克隆抗体。建立酶联免疫吸附方法检测DTX。用OA-OVA作包被抗原，用碳酸盐缓冲液（pH9.6）稀释，包被96孔酶标板，每孔100µl，4℃过夜；弃去残夜，96孔酶标板用PBS-T洗三次，用1%PVA-PBS溶液封闭，37℃3h，4℃保存待用。测定时，弃去封闭液，洗板三次，加入50µl系列稀释的DTX-PBS标准物质溶液或海水或贝肉萃取液样品，再加入适当稀释的抗鳍藻毒素单克隆抗体溶液，振摇混匀，室温放置30min，37℃恒温1h，洗板，加入酶标羊抗鼠第二抗体，37℃恒温40min；洗板，加显色液（TMB-过氧化氢尿素）100µl，0.5mol/lH2SO4终止反应，450nm波长酶标仪测定OD值，以DTX标准物质浓度对OD值或抑制率绘制曲线，对照标准品回归的方程，计算样品DTX的含量。以上所述，仅为本专利技术较佳的具体实施方式，但本专利技术的保护范围并不局限于此，任何熟悉本
的技术人员在本专利技术披露的技术范围内，根据本专利技术的技术方案及其专利技术构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本专利技术的保护范围之内。本文档来自技高网...

【技术保护点】
鳍藻毒素快速酶联免疫检测试剂盒，包括96孔酶标板可拆卸条板、酶标记二抗、含吐温‑20的缓冲盐洗液、底物液和终止液，其特征在于：96孔酶标板上包被有蛋白偶联物的完全抗原，并加入抗鳍藻毒素的单克隆抗体。

【技术特征摘要】
1.鳍藻毒素快速酶联免疫检测试剂盒，包括96孔酶标板可拆卸条板、酶标记二抗、含吐温-20的缓冲盐洗液、底物液和终止液，其特征在于：96孔酶标板上包被有蛋白偶联物的完全抗原，并加入抗鳍藻毒素的单克隆抗体。2.如权利要求1所述的鳍藻毒素快速酶联免疫检测试剂盒的制法，其特征在于：将半抗原的腹泻性贝毒主要成分OA与蛋白偶联，合成完全抗原；将获得的完全抗原免疫小鼠，待小鼠血清滴度达到预期后，细胞融合，获得抗鳍藻毒素的单克隆阳性细胞株；扩大培养后，制得抗鳍藻毒素的单克隆抗体；合成的...

【专利技术属性】
技术研发人员：许道艳，刘磊，梁玉波，刘仁沿，
申请(专利权)人：国家海洋环境监测中心，大连海葵环境监测科技有限公司，
类型：发明
国别省市：辽宁,21