伪狂犬病毒基因工程gB重组弱毒疫苗株及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种伪狂犬病毒基因工程gB重组弱毒疫苗株及应用，本发明专利技术利用CRISPR/Cas9结合同源重组等技术，以伪狂犬病毒疫苗株Bartha‑K61基因组为骨架，通过将Bartha‑K61的gB基因替换为我国流行的伪狂犬病毒变异株JS‑2012株的gB基因，成功获得一株重组伪狂犬病毒Bar‑JS‑gB(BJB)。BJB具有稳定的遗传性，以之作为疫苗株制备的灭活疫苗免疫小鼠比Bartha‑K61株制备的灭活疫苗更能有效抵抗强毒株JS‑2012株攻击。这显示BJB株具有更好的免疫原性，更能有效控制我国PRV变异株的流行，将在我国控制猪伪狂犬病上发挥重要作用。

Pseudorabies virus gene engineering gB recombinant attenuated vaccine strain and its application

The invention discloses a pseudorabies virus gene engineering recombinant gB vaccine strain and application, the invention combines CRISPR/Cas9 with homologous recombination technology to pseudorabies virus vaccine strain Bartha K61 genome as a skeleton, through the gB gene Bartha K61 replacement for our popular variant of pseudorabies virus strain JS 2012. The gB gene successfully obtained a recombinant pseudorabies virus Bar JS gB (BJB). BJB has genetic stability, as inactivated vaccine inactivated vaccine in mice immunized with vaccine strain preparation than Bartha strain K61 preparation can be more effective against 2012 strains of virulent JS attack. This shows that BJB strain has better immunogenicity and can effectively control the prevalence of PRV variants in China, and will play an important role in controlling pseudorabies in china.

【技术实现步骤摘要】
伪狂犬病毒基因工程gB重组弱毒疫苗株及应用
本专利技术涉及微生物领域，具体涉及一种伪狂犬病毒
，特别涉及一种伪狂犬病毒基因工程gB重组弱毒疫苗株及应用。
技术介绍
猪伪狂犬病(Pseudorabies，PR)是目前严重危害我国养猪业的主要疫病之一，该病是由伪狂犬病毒(PseudorabiesVirus，PRV)感染引起的，其主要临床症状以典型的神经系统疾病、高烧、奇痒和呼吸困难，母猪出现死胎、木乃伊胎等繁殖障碍以及仔猪高致死率为特征。PRV属于疱疹病毒科甲型疱疹病毒亚科，其基因组为线状双链DNA，长约150kb，由长独特区(UL)、短独特区(US)及US两侧的重复序列所组成，编码70多种蛋白，其中存在一些病毒复制非必须基因，其缺失不影响病毒复制，但能使病毒毒力减弱，如gE、gI、gG和TK。gE蛋白还作为免疫鉴别诊断分子，在广泛使用的伪狂犬病毒疫苗株，如Bartha-K61、BUK和Bucharest等，均存在该蛋白基因的缺失，以便于通过血清学方法区分免疫动物与野毒感染动物，有利于该病毒的根除。猪伪狂犬病最早发生于美国，我国于20世纪60年代初在猪群中也出现了该病流行。在上世纪70年代，我国从匈牙利引入伪狂犬病毒弱毒疫苗株Bartha-K61，并在全国推广使用，使我国猪伪狂犬病得到有效控制。但2011年末以来，猪伪狂犬病在我国重新爆发，许多Bartha-K61免疫猪场也出现该病的大面积流行，造成了养猪业巨大经济损失。多份研究表明，我国出现了伪狂犬病毒变异株，其流行导致了伪狂犬病的重新爆发。与经典伪狂犬病毒相比，伪狂犬病毒变异株毒力出现增强，抗原也出现变异，Bartha-K61疫苗对变异株攻击不能提供完全免疫保护。为了有效控制伪狂犬病毒变异株的流行，有必要针对PRV变异毒株研制具有良好免疫保护效果的新型弱毒疫苗，控制猪伪狂犬病，提高养猪业经济效益。
技术实现思路
为了解决以上现有技术中猪伪狂犬病疫苗不能抵抗猪伪狂犬变异株感染等问题，本专利技术提供了一种可用于制备免疫效率高的疫苗的伪狂犬病毒基因工程gB重组病毒Bar-JSgB(BJB)，该疫苗株是在以经典伪狂犬病毒弱毒疫苗株Bartha-K61为骨架，将其主要保护性抗原gB基因编码区替换为伪狂犬变异株JS-2012的gB基因编码区，将Bartha-K61的弱毒特性与变异株JS-2012gB蛋白的免疫原性结合，获得的重组毒株。本专利技术利用CRISPR/Cas9结合同源重组等技术，以伪狂犬病毒疫苗株Bartha-K61基因组为骨架，通过将Bartha-K61的gB基因替换为我国流行的伪狂犬病毒变异株JS-2012株的gB基因，成功获得一株重组伪狂犬病毒即：Bar-JSgB(BJB)。BJB具有稳定的遗传性，以之作为疫苗株制备的灭活疫苗免疫小鼠比Bartha-K61株制备的灭活疫苗更能有效抵抗强毒株JS-2012株攻击。这显示BJB株具有更好的免疫原性，在控制我国流行的PRV变异株上具有更好的效果，可在我国控制PR上发挥重要作用。本专利技术还提供一种上述基因工程gB重组疫苗株在制备免疫力高的疫苗中的应用。为了解决上述技术问题，本专利技术通过如下技术方案实现：在本专利技术的一个方面，提供了一种重组伪狂犬病毒，包含伪狂犬病毒弱毒疫苗株Bartha-K61的基因组核酸，所述Bartha-K61基因组在伪狂犬病毒gB蛋白基因区域包含一个突变，将Bartha-K61的gB基因替换为JS-2012的gB基因，即，采用CRISPR/Cas9技术结合同源重组，对Bartha-K61进行gB基因区域缺失的同时，插入JS-2012的gB基因区域序列。所述突变选自：在Bartha-K61基因组序列(GenBankAccessionno.JF797217.1)的15638-18998位核苷酸进行全部缺失，缺失的同时，插入编码伪狂犬病毒变异毒株JS-2012基因组序列(GenBankAccessionno-KP257591.1)16403-19683位核苷酸序列(SEQIDNo13)，使JS-2012gB蛋白的全部核苷酸序列插入缺失区域。Bartha-K61基因组在gB基因缺失区域插入JS-2012gB基因区域之后获得一株重组伪狂犬病毒即：Bar-JSgB(BJB)。在本专利技术的另一方面，提供了一种核酸分子，包含伪狂犬病毒弱毒疫苗株Bartha-K61的基因组多核苷酸序列，该多核苷酸序列在编码伪狂犬病毒gB蛋白的基因区域包含一个突变，将Bartha-K61的gB基因替换为JS-2012的gB基因，即，对Bartha-K61进行gB基因区域缺失的同时，插入JS-2012的gB基因区域序列。所述缺失选自：Bartha-K61基因组序列15638-18998位核苷酸序列的缺失，使Bartha-K61gB蛋白基因区域全部缺失。所述插入选自：在上述缺失区(Bartha-K61基因组序列15638-18998位核苷酸)插入编码伪狂犬病毒变异毒株JS-2012基因组序列16403-19683位核苷酸序列(SEQIDNo13)，使JS-2012gB蛋白的全部核苷酸序列插入缺失区域。在本专利技术的另一方面，还提供了一种伪狂犬病毒弱毒疫苗株，包含猪伪狂犬病毒弱毒疫苗株Bartha-K61的基因组核酸，所述Bartha-K61基因组在编码伪狂犬病毒gB蛋白的基因区域包含一个突变，该突变是：对Bartha-K61基因组第15638-18998位核苷酸序列进行缺失，在该缺失区域插入猪伪狂犬病毒变异毒株JS-2012基因组第16403-19683位核苷酸序列。在本专利技术的另一方面，还提供了一种上述重组伪狂犬病毒在制备预防或治疗猪伪狂犬病的疫苗中的应用。在本专利技术的另一方面，还提供了一种上述伪狂犬病毒弱毒疫苗株在制备预防或治疗猪伪狂犬病的疫苗中的应用。所述的应用中，疫苗的制备过程为：取含有BJB或Bartha-K61病毒的病毒液，甲醛灭活，加入佐剂乳化即得。所述的应用中，病毒液与佐剂的重量比为1∶1。所述的应用，病毒液中病毒含量为108.0TCID50/mL。所述的应用，疫苗中病毒抗原含量大于107.0TCID50/mL。有益效果从我国发病猪群分离的伪狂犬病毒(PRV)毒株PRVJS-2012，通过CRISPR/Cas9结合同源重组技术将PRVJS-2012的gB基因替换入PRV弱毒疫苗株Bartha-K61，即，将原Bartha-K61的gB基因替换为JS-2012的gB基因，通过筛选纯化获得重组病毒Bar-JSgB(BJB)。重组病毒BJB引起的细胞病变、病毒生长曲线和体外增殖特性与亲本毒Bartha-K61较为一致。由本专利技术伪狂犬病毒基因工程gB重组弱毒疫苗株BJB制备的灭活疫苗，免疫小鼠后可有效诱导机体产生免疫应答，对免疫小鼠抵抗伪狂犬病毒变异株的致死性攻击提供有效的免疫保护，说明本专利技术的基因工程gB重组弱毒疫苗株BJB具有较好的免疫原性，可作为新的疫苗候选株，非常有利于变异伪狂犬病毒的预防和控制。附图说明图1CRISPR/Cas9结合同源重组技术替换PRVBartha-K61的gB基因为PRV-JS-2012的gB基因的基因编辑设计示意图。图2是本专利技术筛选鉴定重组伪狂犬病毒Bar-JSgB(BJB)的PCR检测结果图；图本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种伪狂犬病毒基因工程gB重组弱毒病毒，其特征在于，包含伪狂犬病毒弱毒疫苗株Bartha‑K61的基因组核酸，所述Bartha‑K61基因组在病毒gB蛋白的基因区域包含一个突变，将Bartha‑K61的gB基因替换为JS‑2012的gB基因，即，对Bartha‑K61进行gB基因区域缺失的同时，插入JS‑2012的gB基因区域序列；所述缺失选自：(1)Bartha‑K61基因组序列15638‑18998位核苷酸序列的缺失，使Bartha‑K61 gB基因区域全部缺失；所述插入选自：(a)在(1)所述缺失区插入编码伪狂犬病毒变异株JS‑2012基因组序列16403‑19683位核苷酸序列，使JS‑2012gB蛋白的全部核苷酸序列插入缺失区域。

【技术特征摘要】
1.一种伪狂犬病毒基因工程gB重组弱毒病毒，其特征在于，包含伪狂犬病毒弱毒疫苗株Bartha-K61的基因组核酸，所述Bartha-K61基因组在病毒gB蛋白的基因区域包含一个突变，将Bartha-K61的gB基因替换为JS-2012的gB基因，即，对Bartha-K61进行gB基因区域缺失的同时，插入JS-2012的gB基因区域序列；所述缺失选自：(1)Bartha-K61基因组序列15638-18998位核苷酸序列的缺失，使Bartha-K61gB基因区域全部缺失；所述插入选自：(a)在(1)所述缺失区插入编码伪狂犬病毒变异株JS-2012基因组序列16403-19683位核苷酸序列，使JS-2012gB蛋白的全部核苷酸序列插入缺失区域。2.一种核酸分子，其特征在于，包含伪狂犬病毒弱毒疫苗株Bartha-K61的基因组多核苷酸序列，该多核苷酸序列在编码伪狂犬病毒gB基因区域包含一个突变，将Bartha-K61的gB基因替换为JS-2012的gB基因，即，对Bartha-K61进行gB基因区域缺失的同时，插入JS-2012的gB基因区域序列；所述缺失选自：(1)Bartha-K6...

【专利技术属性】
技术研发人员：童光志，于之清，童武，郑浩，李国新，
申请(专利权)人：中国农业科学院上海兽医研究所，
类型：发明
国别省市：上海,31