一种厌氧降解石油烃产甲烷菌群的筛选方法技术

本发明专利技术提供了一种厌氧降解石油烃产甲烷菌群的筛选方法，本发明专利技术以油田采出液和含油污泥作为样品，对其中的菌群进行厌氧培养，在不加入碳源的情况下，菌群只能利用石油烃作为碳源，进而培育筛选出能够利用石油烃作为碳源的菌群，同时为了得到适应性更强的降解石油烃混合菌群；另外，本发明专利技术同时使用油田采出液和含油污泥作为样品，并根据油田采出液和含油污泥中菌群的不同属性分别筛选出产气量大于0.4μmol/d和1.15μmol/d的样品，进而将其混合，得到能够降解石油烃混合菌群的混合物；最后，本发明专利技术同时还考虑了最优油田采集液培养液和最优含油污泥培养液的混合比例，从而确保最终得到的混合菌群具有优秀的降解能力。

Screening method for anaerobic degradation of petroleum hydrocarbon producing methane bacteria group

The invention provides a method for anaerobic degradation of petroleum hydrocarbon producing methane bacteria screening method, the invention uses crude oil and oily sludge as samples, the bacteria were cultured under anaerobic conditions, without adding carbon source, bacteria can only use petroleum hydrocarbon as the carbon source, and then screened for cultivation the use of petroleum hydrocarbon as the carbon source of bacteria, at the same time in order to get more adaptive degradation of petroleum hydrocarbon mixed bacteria; in addition, the invention also use crude oil and oily sludge as samples, and according to the oilfield produced liquid and oily sludge bacteria in different properties. The screening production rate of more than 0.4 mu mol/d and 1.15 mol/d samples, and the mixture can be obtained, the degradation of petroleum hydrocarbon mixed bacteria mixture; finally, the invention also considers the optimal medium and optimal oilfield oily sludge collection liquid The mixing ratio of the culture medium ensures that the resulting mixed microflora has excellent degradation capacity.

【技术实现步骤摘要】
一种厌氧降解石油烃产甲烷菌群的筛选方法
本专利技术属于残余石油利用
，具体涉及一种厌氧降解石油烃产甲烷菌群的筛选方法。
技术介绍
对老油田进行深度开发，提高石油采收率已成为当前老油田开发的中心任务。现有提高采收率的技术存在的主要问题是提高幅度有限，大量的残余石油滞留地下。而怎样利用大量残存在油藏中的石油又成为一项重要课题。通过微生物降解石油产甲烷，从而对残余石油进行利用，成为一条有效途径。微生物厌氧降解石油产甲烷过程是多种菌群参与的多步骤反应，在整个降解过程中，影响反应速率的因素非常多。油藏中的实验也证实了在有机质(特别是残余石油)降解过程中，公认的降解终端产物是甲烷，而电子受体耗尽是甲烷产生的基础，具体来说产甲烷古菌和其它功能菌群协同作用，最终使残余石油得到降解并产生甲烷。而地质学的研究也表明，在数千年来，油藏内部一直自发进行着微生物降解石油产甲烷，因为地球内部的厌氧环境有利于这一过程的进行。有研究表明：油藏中的微生物群体是由微好氧菌群和兼性厌氧型以及严格厌氧型细菌组成的，烃类提供了它们存活的基础条件，其可能原因是随着油藏的开采，会大量注入水和其它物质，这改变了油藏本来的环境。目前，还没有一种简单有效的，筛选厌氧降解石油烃产甲烷菌群的方法出现。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种厌氧降解石油烃产甲烷菌群的筛选方法，本专利技术以油田采出液和含油污泥作为样品，对其中的菌群进行厌氧培养，在不加入碳源的情况下，菌群只能利用石油烃作为碳源，进而培育筛选出能够利用石油烃作为碳源的菌群，同时为了得到适应性更强的降解石油烃混合菌群；另外，本专利技术同时使用油田采出液和含油污泥作为样品，并根据油田采出液和含油污泥中菌群的不同属性分别筛选出产气量大于0.4μmol/d和1.15μmol/d的样品，进而将其混合，得到能够降解石油烃混合菌群的混合物；最后，本专利技术同时还考虑了最优油田采集液培养液和最优含油污泥培养液的混合比例，从而确保最终得到的混合菌群具有优秀的降解能力。本专利技术的技术方案是，一种厌氧降解石油烃产甲烷菌群的筛选方法，包括以下步骤：S1、取样：分别从油田的不同区域采集油田采出液和含油污泥，作为样品；S2、厌氧培养：将所述油田采集液和含油污泥分别按照厌氧条件培养；S3、培养结果测定：一段时间后，测量油田采出液和含油污泥的甲烷产量；S4：菌种混合：筛选油田采集液中产气量大于0.4μmol/d和含油污泥中产气量大于1.15μmol/d的样品，取培养液分别作为最优油田采集液培养液和最优含油污泥培养液，并将最优油田采集液培养液和最优含油污泥培养液进行混合，将最优油田采集液培养液和最优含油污泥培养液分别以体积比为1∶1、1∶2、1∶3、1∶5和2∶1、3∶1、5∶1进行混合，作为样品分别按照厌氧条件培养，测量甲烷产量，筛选出甲烷产气量最大培养液，即得到含有降解石油烃混合菌群的混合物。所述筛选方法以油田采出液和含油污泥作为样品，对其中的菌群进行厌氧培养，在不加入碳源的情况下，菌群只能利用石油烃作为碳源，进而培育筛选出能够利用石油烃作为碳源的菌群，同时为了得到适应性更强的降解石油烃混合菌群；另外，本专利技术同时使用油田采出液和含油污泥作为样品，并根据油田采出液和含油污泥中菌群的不同属性分别筛选出产气量大于0.4μmol/d和1.15μmol/d的样品，进而将其混合，得到能够降解石油烃混合菌群的混合物；最后，本专利技术同时还考虑了最优油田采集液培养液和最优含油污泥培养液的混合比例，从而确保最终得到的混合菌群具有优秀的降解能力。为保证样品质量和多样性，优选的，步骤S1中，所述油田采出液的原油密度为0.87-0.93g/cm3，原油粘度为61.6-169.3mPas，采集所述油田采出液后，使用氮气密封保存；取距地面30cm以下被石油污染的含油率为5.8-11.3％的含油污泥，取样后在-5℃下厌氧保存。在油田的不同区域采集油田采出液或含油污泥，并将不同的样品分别按照厌氧条件培养；厌氧培养为：取30-40g的油田采出液或含油污泥，和60mL第一无机盐富集培养基充入到120mL无菌瓶中，30℃下富集培养直到培养瓶中能检测到稳定的甲烷产量，培养结束。本专利技术中，使用的所述第一无机盐富集培养基的成分及含量为：KH2PO45.0g，K2HPO45.0g，NH4Cl5.0g，NaCl1.0g，MgCl22.0g，CaCl20.1g，酵母粉0.5g，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g，硫酸亚铁铵0.5g和刃天青1.0mg，加水定容至1L。所述第一无机盐富集培养基能够满足菌群生长的需要，保证菌群的正常生长。为使菌群生长的更好，优选的，所述第一无机盐富集培养基中还包括维生素水溶液5mL，所述维生素水溶液中维生素的成分及浓度为：维生素H2.0mg/L，维生素B92.0mg/L，维生素B610mg/L，维生素B15.0mg/L，维生素B25.0mg/L，维生素B120.1mg/L，硫辛酸5.0mg/L。进一步的，所述第一无机盐富集培养基中还包括微量元素水溶液5mL，所述微量元素水溶液中的成分及浓度为：次氮基三乙酸1.5g/L，氯化钴0.1g/L，无水氯化锰0.1g/L，氯化亚铁0.1g/L，六水氯化钴0.18g/L，氯化锌0.1g/L，五水硫酸铜0.01g/L，十二水硫酸铝钾0.02g/L，硼酸0.01g/L，两水钼酸钠0.01g/L，六水氯化镍0.025g/L。所述第一无机盐富集培养基的配制方法为：将培养基中除刃天青、维生素水溶液和微量元素水溶液之外的其他组分混合，加热煮沸的同时不断通入氮气，直到培养基由粉色变为无色，停止加热，待体系冷却后，加入维生素水溶液和微量元素水溶液，灭菌后加入最终质量比为0.03％的九水硫化钠、最终质量比为0.02％的碳酸氢钠，以及刃天青，密封保存。其中，刃天青需要现用现配。由于含油污泥的粘度和浓度较大，为便于后续的厌氧培养，优选的，在对所述含油污泥进行厌氧培养之前，向所述含油污泥中加入10倍重量的第一无机盐富集培养基进行初级培养6-8小时，初级培养结束后取上清液继续进行厌氧培养。本专利技术中，使用色谱仪对生成的甲烷产量进行测定，其中FID的温度为200℃，气化进样器的温度为150℃；色谱柱的初温为35℃，保持15min后以5℃/min的升温速度升温至200℃，并保持5min，取样时使用气体收集器从样品上方收集气体，然后再用密封注射器取样和进样，进样体积为0.3mL。步骤S4中，取按不同比例混合后的样品的上清液15ml，并加入第二无机盐富集培养基60mL，培养260天。所述第二无机盐富集培养基的成分及含量为：KH2PO45.0g，K2HPO45.0g，NH4Cl5.0g，NaCl1.0g，MgCl22.0g，CaCl20.1g，酵母粉0.5g，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g，硫酸亚铁铵0.5g和刃天青1.0mg，加水定容至1L。所述第二无机盐富集培养基中还包括维生素水溶液5mL，所述维生素水溶液中维生素的成分及浓度为：维生素H2.0mg/L，维生素B92.0mg/L，维生素B610mg/L，维生素B15.0mg/L，维生素B25.0mg/L，维生素B120.1mg/L，硫辛酸5.0mg/L。所述第二无机盐富集培养基中还包括微量元素水溶本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种厌氧降解石油烃产甲烷菌群的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、取样：分别从油田的不同区域采集油田采出液和含油污泥，作为样品；S2、厌氧培养：将所述油田采集液和含油污泥分别按照厌氧条件培养；S3、培养结果测定：一段时间后，测量油田采出液和含油污泥的甲烷产量；S4：菌种混合：筛选油田采集液中产气量大于0.4μmol/d和含油污泥中产气量大于1.15μmol/d的样品，取培养液分别作为最优油田采集液培养液和最优含油污泥培养液，并将最优油田采集液培养液和最优含油污泥培养液进行混合，将最优油田采集液培养液和最优含油污泥培养液分别以体积比为1∶1、1∶2、1∶3、1∶5和2∶1、3∶1、5∶1进行混合，作为样品分别按照厌氧条件培养，测量甲烷产量，筛选出甲烷产气量最大培养液，即得到含有降解石油烃混合菌群的混合物。

【技术特征摘要】
1.一种厌氧降解石油烃产甲烷菌群的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、取样：分别从油田的不同区域采集油田采出液和含油污泥，作为样品；S2、厌氧培养：将所述油田采集液和含油污泥分别按照厌氧条件培养；S3、培养结果测定：一段时间后，测量油田采出液和含油污泥的甲烷产量；S4：菌种混合：筛选油田采集液中产气量大于0.4μmol/d和含油污泥中产气量大于1.15μmol/d的样品，取培养液分别作为最优油田采集液培养液和最优含油污泥培养液，并将最优油田采集液培养液和最优含油污泥培养液进行混合，将最优油田采集液培养液和最优含油污泥培养液分别以体积比为1∶1、1∶2、1∶3、1∶5和2∶1、3∶1、5∶1进行混合，作为样品分别按照厌氧条件培养，测量甲烷产量，筛选出甲烷产气量最大培养液，即得到含有降解石油烃混合菌群的混合物。2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤S4中，取按不同比例混合后的样品的上清液15ml，并加入第二无机盐富集培养基60mL，培养260天。3.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，所述第二无机盐富集培养基的成分及含量为：KH2PO45.0g，K2HPO45.0g，NH4Cl5.0g，NaCl1.0g，MgCl22.0g，CaCl20.1g，酵母粉0.5g，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g，硫酸亚铁铵0.5g和刃天青1.0mg，加水定容至1L。4.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于，所述第二无机盐富集培养基中还包括维生素水溶液5mL，所述维生素水溶液中维生素的成分及浓度为：维生素H2.0mg/L，维生素B92.0mg/L，维生素B610mg/L，维生素B15.0mg/L，维生素B25.0mg/L，维生素B120.1mg/...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡恒宇，
申请(专利权)人：临沂大学，
类型：发明
国别省市：山东,37