一种基于叶脉网眼结构仿生的多层细胞培养微器件制造技术

本发明专利技术提供了一种基于叶脉网眼结构仿生的多层细胞培养微器件，属于采用仿生手段进行微器件设计领域。该多层细胞培养微器件由三层结构组成，分别为细胞进样层、中间过渡层和仿生培养层。采用具有通孔结构的过渡层连接细胞进样层与仿生培养层。其中仿生培养层上的微通道模拟叶脉网络结构，细胞培养池模拟网眼结构镶嵌于微通道网络通道的分岔点处，用于连接微通道网络与培养池的微柱间隙结构模拟叶脉导管侧壁上的纹孔结构。本发明专利技术的多层细胞培养微器件具有较高的生物兼容性，制作简单，成本低，可以实现大批量生产。

A multilayer cell culture micro device based on vein mesh structure

The invention provides a multilayer cell culturing micro device based on a vein mesh structure bionic, which belongs to the field of micro device design by adopting bionic means. The multi cell culture micro device consists of three layers, namely, cell introduction layer, intermediate transition layer and bionic culture layer. A transition layer with a through hole structure is connected with the cell injection layer and the bionic culture layer. The micro channel bionic culture layer on the simulation of the vein network structure, cell culture pool simulation bifurcation point mesh structure embedded in the micro channel network channel, used to connect the simulation pit structure of veins on the side wall of the catheter micro micro channel network structure pillargap and training pool. The multilayer cell culture micro device has high biological compatibility, simple manufacture and low cost, and can realize mass production.

【技术实现步骤摘要】
一种基于叶脉网眼结构仿生的多层细胞培养微器件
本专利技术属于采用仿生手段进行微器件设计领域，具体涉及一种基于叶脉网眼结构仿生的多层细胞培养微器件，该细胞培养微器件用于构建细胞体外培养动态稳定均一的流体流动微环境。
技术介绍
细胞是组成生物体的基本单元，细胞研究对于揭示生命规律、诊断疾病、筛选药物等具有重要意义。细胞培养是进行细胞研究的基础，传统的细胞体外培养往往采用培养皿、培养瓶或培养板，是一种静态的培养，与细胞在体流动微环境不同。微流控器件的微通道网络与细胞在体时所处的脉管系统非常相似，可以进行动态的培养，因此采用微流控技术进行细胞培养使细胞在体微环境的体外模拟和控制成为可能。培养池是微流控细胞培养器件的重要功能单元之一，为保证培养区内的各细胞具有相同的微环境，要求细胞培养区的流场具有均一性。同时，为保证实验的复现性，要求细胞培养区的流场具有稳定性。因此如何设计培养池成为微器件设计的关键。大自然经过长期的进化形成了许多优化结构。双子叶植物叶脉能够将从根部运至叶柄的液体均匀的输运至每个叶肉细胞，供给叶肉细胞进行各项生理活动。双子叶植物叶脉的这种水力特性与结构密不可分。双子叶植物叶脉具有如下特征：叶脉整体呈网状分布，且主脉中液体流量变化随中间脉密度的提高而逐渐趋于稳定，因此流量的变化对叶肉细胞影响小、输送至叶片各区域养分均匀，并且高密度的闭合叶脉可以保证液体输运不会由于局部叶脉损坏或混入气体而阻塞，保证了网眼区域内液体供给的稳定性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，克服现有技术的缺点，采用提取生物体内影响流体流动微环境的微结构的方法，设计一种能够构建动态稳定均一的细胞体外培养流体流动微环境的细胞培养微器件，采用微加工技术制作该微器件并用于细胞体外培养。本专利技术的技术方案：一种基于叶脉网眼结构仿生的多层细胞培养微器件，包括细胞进样层1、中间过渡层2和仿生培养层3，细胞进样层1位于最上层，中间过渡层2位于中间层，仿生培养层3位于底层；所述的细胞进样层1上设有4个通孔和1个对齐孔，4个通孔分别为培养液进样孔4、细胞进样孔5、细胞出样孔8和废液排出孔9，对齐孔7位于细胞进样层1的中心处，培养液进样孔4和废液排出孔9对称位于对齐孔7左右端，细胞进样孔5和细胞出样孔8对称位于对齐孔7上下端；细胞进样孔5和细胞出样孔8间通过通道6连通，通道6成对对称布置；与细胞出样孔8相连的通道6侧横向设有梯形微坝18，用于阻挡细胞被冲出培养池；所述的中间过渡层2上设有3个通孔，从左到右依次为培养液进样通孔10、培养池连通孔11和废液排出通孔12，培养液进样通孔10与细胞进样层1的培养液进样孔4相通，废液排出通孔12与细胞进样层1的废液排出孔9相通，培养池连通孔11与细胞进样层1的对齐孔7相对，且形状大小相同；所述的仿生培养层3上设有培养液储液池13、仿生培养池15和废液储液池17，培养液从培养液进样孔4通过培养液进样通孔10进入培养液储液池13，培养液储液池13与仿生培养池15间通过培养液进样通道14相连，仿生培养池15与废液储液池17间通过废液出样通道16相连；所述的培养液储液池13分为储液区19和溢流区20，储液区19位于培养液储液池13的最内部，储液区19由多个栅栏微柱21围成，储液区19的内切圆直径不小于培养液进样通孔10的内切圆直径，培养液通过栅栏微柱间隙22进入溢流区20，溢流区20与培养液进样通道14相通；所述的仿生培养池15设有两层微柱，为内微柱层和外微柱层，内微柱层是由多个排布紧密的内微柱24围成的多边形结构，由内微柱24围成的多边形结构内部为细胞培养区23，培养液通过内微柱24间的内微柱间隙28进入细胞培养区23；外微柱层位于内微柱层外侧，外微柱层中排布的外微柱25的数量与多边形的边数相同，将仿生培养池15内部的通道分为一级分岔子通道26和二级分岔子通道27；一级分岔子通道26为仿生培养池15与外微柱层间形成的通道、外微柱层中外微柱25间形成的通道，一级分岔子通道26的水力直径符合Murray定律，即一级分岔子通道26水力直径的三次方之和等于培养液进样通道14水利直径的三次方；二级分岔子通道27为外微柱层和内微柱层间形成的通道，二级分岔子通道27为最后一级子通道，模拟叶片最细的叶脉，与一级分岔子通道26具有相同的水力直径。所述的细胞进样层1上面的通道6关于对齐孔7成对对称布置，使细胞从多个方向进入培养池，利于细胞均匀的分布于细胞培养区23内；所述的细胞进样层1上面的通道6与对齐孔7具有相同的深度；所述的细胞进样层1上面的梯形微坝18的高度与通道6的深度相同；所述的细胞进样层1上面的对齐孔7与培养池连通孔11、细胞培养区23具有相同的形状和大小，便于键合对准。所述的仿生培养层3设计灵感来源于双子叶植物叶片内的叶脉结构。叶脉等级分岔和闭合的结构特点增加了叶片内水分输运的冗余度，为叶脉内调整液体流量变化提供了多条路径。受这一现象的启发，本专利技术设计了仿叶脉结构的培养层，主要是仿叶脉细脉处的结构。所述仿生培养层3上的培养液进样通道14、一级分岔子通道26、二级分岔子通道27模拟叶脉网络结构，具有等级分岔特点；所述仿生培养层3上的仿生培养池15模拟网眼结构，具有多边形特点；所述仿生培养池上的内微柱间隙28模拟叶脉导管侧壁上的纹孔结构，用于连接二级分岔子通道27与细胞培养区23。所述的细胞进样层1、中间过渡层2和仿生培养层3采用热固性聚合物聚二甲基硅氧烷(PDMS)，或者热塑性聚合物聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)或聚苯乙烯(PS)或聚碳酸酯(PC)材料。所述的细胞进样层1、中间过渡层2和仿生培养层3采用微加工工艺制作而成，制作过程为：采用光刻技术和干法刻蚀技术制作微模具、采用软刻蚀技术或热压技术将微模具上的图形转移至微器件材料上。所述的中间过渡层2使用的材料厚度小于等于模具上的微柱的高度，以形成通孔。所述的细胞进样层1采用微流控芯片专用打孔器在培养液进样孔4、细胞进样孔5、细胞出样孔8和废液排出孔9对应位置打出通孔。所述的细胞进样层1、中间过渡层2和仿生培养层3通过氧等离子体处理或者热压的方法键合在一起。所述的键合过程中，细胞进样层1与中间过渡层2之间需要对准，中间过渡层2与仿生培养层3之间需要对准，所述的对准过程采用可视化的显微成像技术，将对准过程呈现在计算机屏幕上，通过调整上下平台间的位置使芯片层之间实现对准。所述的细胞培养微器件在键合好之后通入无水乙醇以保持封闭通道及培养池内表面的亲水性，并且起到消毒灭菌的作用。所述的细胞培养微器件通过示踪粒子测速的方法来测量细胞培养区23内流体的流动速度。所述的细胞培养微器件、硅胶管和管接头在用于细胞培养之前高温高压灭菌1小时，灭好菌后包被鼠尾胶原蛋白或纤连蛋白，包被好胶原后置于孵育箱过夜，利于后续细胞贴壁。所述的细胞培养微器件在注入细胞后静置片刻，置于显微镜下观察细胞注入情况，放入CO2孵育箱静态孵育至大多数细胞贴壁。所述的细胞培养微器件在细胞贴壁后开始进行动态培养。所述的细胞培养微器件在动态培养过程中每隔24小时对培养池内的细胞进行一次观察拍照至细胞铺满整个培养池。统计每个时间段内细胞的数量，绘制细胞生长曲线。本专利技术的有益效果：成对对称分布的细胞进样通道通过多通道多方向的细胞注本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于叶脉网眼结构仿生的多层细胞培养微器件，其特征在于，所述的多层细胞培养微器件包括细胞进样层(1)、中间过渡层(2)和仿生培养层(3)，细胞进样层(1)位于最上层，中间过渡层(2)位于中间层，仿生培养层(3)位于底层；所述的细胞进样层(1)上设有4个通孔和1个对齐孔，4个通孔分别为培养液进样孔(4)、细胞进样孔(5)、细胞出样孔(8)和废液排出孔(9)，对齐孔(7)位于细胞进样层(1)的中心处，培养液进样孔(4)和废液排出孔(9)对称位于对齐孔(7)左右端，细胞进样孔(5)和细胞出样孔(8)对称位于对齐孔(7)上下端；细胞进样孔(5)和细胞出样孔(8)间通过通道(6)连通，通道(6)成对对称布置；与细胞出样孔(8)相连的通道(6)侧横向设有梯形微坝(18)，用于阻挡细胞被冲出培养池；所述的中间过渡层(2)上设有3个通孔，从左到右依次为培养液进样通孔(10)、培养池连通孔(11)和废液排出通孔(12)，培养液进样通孔(10)与细胞进样层(1)的培养液进样孔(4)相通，废液排出通孔(12)与细胞进样层(1)的废液排出孔(9)相通，培养池连通孔(11)与细胞进样层(1)的对齐孔(7)相对，且形状大小相同；所述的仿生培养层(3)上设有培养液储液池(13)、仿生培养池(15)和废液储液池(17)，培养液从培养液进样孔(4)通过培养液进样通孔(10)进入培养液储液池(13)，培养液储液池(13)与仿生培养池(15)间通过培养液进样通道(14)相连，仿生培养池(15)与废液储液池(17)间通过废液出样通道(16)相连；所述的培养液储液池(13)分为储液区(19)和溢流区(20)，储液区(19)位于培养液储液池(13)的最内部，储液区(19)由多个栅栏微柱(21)围成，储液区(19)的内切圆直径不小于培养液进样通孔(10)的内切圆直径，培养液通过栅栏微柱间隙(22)进入溢流区(20)，溢流区(20)与培养液进样通道(14)相通；所述的仿生培养池(15)设有两层微柱，为内微柱层和外微柱层，内微柱层是由多个排布紧密的内微柱(24)围成的多边形结构，由内微柱(24)围成的多边形结构内部为细胞培养区(23)，培养液通过内微柱(24)间的内微柱间隙(28)进入细胞培养区(23)；外微柱层位于内微柱层外侧，外微柱层中排布的外微柱(25)的数量与多边形的边数相同，将仿生培养池(15)内部的通道分为一级分岔子通道(26)和二级分岔子通道(27)；一级分岔子通道(26)为仿生培养池(15)与外微柱层间形成的通道、外微柱层中外微柱(25)间形成的通道，一级分岔子通道(26)的水力直径符合Murray定律，即一级分岔子通道(26)水力直径的三次方之和等于培养液进样通道(14)水利直径的三次方；二级分岔子通道(27)为外微柱层和内微柱层间形成的通道，二级分岔子通道(27)为最后一级子通道，模拟叶片最细的叶脉，与一级分岔子通道(26)具有相同的水力直径。...

【技术特征摘要】
1.一种基于叶脉网眼结构仿生的多层细胞培养微器件，其特征在于，所述的多层细胞培养微器件包括细胞进样层(1)、中间过渡层(2)和仿生培养层(3)，细胞进样层(1)位于最上层，中间过渡层(2)位于中间层，仿生培养层(3)位于底层；所述的细胞进样层(1)上设有4个通孔和1个对齐孔，4个通孔分别为培养液进样孔(4)、细胞进样孔(5)、细胞出样孔(8)和废液排出孔(9)，对齐孔(7)位于细胞进样层(1)的中心处，培养液进样孔(4)和废液排出孔(9)对称位于对齐孔(7)左右端，细胞进样孔(5)和细胞出样孔(8)对称位于对齐孔(7)上下端；细胞进样孔(5)和细胞出样孔(8)间通过通道(6)连通，通道(6)成对对称布置；与细胞出样孔(8)相连的通道(6)侧横向设有梯形微坝(18)，用于阻挡细胞被冲出培养池；所述的中间过渡层(2)上设有3个通孔，从左到右依次为培养液进样通孔(10)、培养池连通孔(11)和废液排出通孔(12)，培养液进样通孔(10)与细胞进样层(1)的培养液进样孔(4)相通，废液排出通孔(12)与细胞进样层(1)的废液排出孔(9)相通，培养池连通孔(11)与细胞进样层(1)的对齐孔(7)相对，且形状大小相同；所述的仿生培养层(3)上设有培养液储液池(13)、仿生培养池(15)和废液储液池(17)，培养液从培养液进样孔(4)通过培养液进样通孔(10)进入培养液储液池(13)，培养液储液池(13)与仿生培养池(15)间通过培养液进样通道(14)相连，仿生培养池(15)与废液储液池(17)间通过废液出样通道(16)相连...

【专利技术属性】
技术研发人员：李经民，魏娟，刘冲，江洋，刘涛，
申请(专利权)人：大连理工大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21