基于氧化石墨烯的核酸结合蛋白提取方法技术

一种基于氧化石墨烯的核酸结合蛋白提取方法，属于新型蛋白富集技术领域。本发明专利技术通过将待测细胞加入含有氧化石墨烯的细胞裂解液中进行裂解，核酸以及核酸结合蛋白会被氧化石墨烯所吸附，形成氧化石墨烯‑核酸‑核酸结合蛋白复合物。离心收集复合物并将其重悬于蛋白变性液中并超声处理，最后收集上清液中的核酸结合蛋白即可。本发明专利技术成本低，操作简单，提取过程不到1分钟，可以简单高效的提取核酸结合蛋白，对于核酸结合蛋白质谱研究具有重要意义。

Method for extracting nucleic acid binding protein based on graphene oxide

The invention relates to a nucleic acid binding protein extraction method based on graphene oxide, belonging to the novel protein enrichment technical field. Through the cleavage of cell lysate to be tested cells containing graphene oxide, nucleic acid binding and protein nucleic acid can be adsorbed by the formation of graphene oxide, graphene oxide nucleic acid binding protein nucleic acid complexes. The complexes were collected by centrifugation and then re placed in the protein denatured liquid and treated by ultrasound. Finally, the nucleic acid binding proteins in the supernatant were collected. The invention has the advantages of low cost, simple operation, less than 1 minutes of extraction, and simple and efficient extraction of nucleic acid binding protein, which is of great significance for the study of nucleic acid binding protein mass spectrometry.

【技术实现步骤摘要】
基于氧化石墨烯的核酸结合蛋白提取方法
本专利技术涉及的是一种生物检测领域的技术，具体是一种基于氧化石墨烯的核酸结合蛋白提取方法。
技术介绍
核酸结合蛋白包括DNA结合蛋白和RNA结合蛋白，参与调控多种细胞功能，包括DNA复制和转录，RNA加工和翻译，基因沉默以及端粒长度的维持等。RNA结合蛋白可以与RNA形成核糖核蛋白复合物进而调控RNA的合成和降解，也可以与非编码RNA比如microRNA结合调控信使RNA(mRNA)的转录后加工。DNA结合蛋白包括核小体蛋白和转录因子，在DNA复制，转录以及修复的过程中发挥着非常重要的作用。核酸结合蛋白表达或功能的缺失会导致许多疾病的发生，比如癌症和代谢性疾病。由于核酸结合蛋白重要的生物学功能，使得其在细胞内的蛋白质谱以及在不同生理病理条件下的活化状态的研究变得尤为重要。对核酸结合蛋白研究常用的方法包括染色质免疫沉淀，电泳迁移率实验，染色体捕获技术，DNA或RNA亲和层析，并应用质谱对核酸结合蛋白进行鉴定。这些方法或以单个或多个基因为中心，研究与其结合的蛋白，或者是以蛋白为中心，研究与其结合的核酸片段。这些技术的特点是专一性高，但是通量低，不能作为核酸结合蛋白组学研究的方法。近几年发展了一些以基因为中心的，可以高通量研究DNA结合蛋白或者RNA结合蛋白的方法。比如，蛋白微阵列芯片技术，通过人工合成并串联上百个已被证明可以和蛋白结合的DNA片段从细胞裂解液中筛选出DNA结合蛋白(Huetal.,2009)。mRNA免疫共沉淀技术利用可以特异性结合mRNA的抗体，通过富集mRNA从而鉴定到RNA结合蛋白(Castelloetal.,2012)(Baltzetal.,2012)。这两种方法虽然可以鉴定到一定量的核酸结合蛋白，但是由于操作复杂，成本高的原因，在核酸结合蛋白质组学研究中的应用有很大的局限性。直到现在仍然没有一种通用的提取核酸结合蛋白的方法，因此发展一种简单高效的核酸结合蛋白提取方法变得尤为必要。通常情况下，核酸结合蛋白在细胞中的丰度很低，因此对核酸结合蛋白特异性的富集将有助于对其后续的分析。由于核酸结合蛋白与核酸结合的特性，因此可以通过富集核酸从而提取到核酸结合蛋白。传统的核酸提取的方法基于苯酚-氯仿体系，在提取过程中会丢失绝大多数的核酸结合蛋白，因此需要发展一种在保证核酸结合蛋白不丢失的前提下富集核酸的新方法。纳米材料比如碳纳米管，石墨烯和氧化石墨烯由于其出色的力学，热力及导电性能被广泛应用于生物医学的研究中，比如生物传感器，药物载体等。以往的研究表明，纳米材料可以通过π-π堆积的作用力稳定的吸附单链核酸。2012年Zhang等人利用碳纳米管吸附核酸的特性，从细胞中提取核酸并利用质谱鉴定到2595个蛋白(Zhangetal.,2012)，该方法虽然简单，但是核酸结合蛋白提取的特异性只有24％。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术只能提取核酸，核酸结合蛋白会在提取过程中全部损失，所以无法用来提取核酸结合蛋白的缺陷，提出一种基于氧化石墨烯的核酸结合蛋白提取方法，该方法成本低，操作简单，提取过程不到1分钟，可以简单高效的提取核酸结合蛋白并有助于疾病发生发展相关的核酸结合蛋白的研究。本专利技术是通过以下技术方案实现的：本专利技术通过将待测细胞加入含有氧化石墨烯的细胞裂解液中进行裂解，离心收集裂解后得到的氧化石墨烯-核酸-核酸结合蛋白复合物并将其重悬于蛋白变性液中并超声处理，然后收集上清液中的核酸结合蛋白即得。所述的待测细胞为所有类型的动物细胞，优选为重悬于缓冲液中并缓慢加入细胞裂解液，进一步优选为将待测细胞重悬于PBS中为5x106个细胞重悬于20μLPBS。所述的细胞裂解液，具体为：每裂解5x106个细胞，溶解500μg氧化石墨烯于500μL250mMSDS中。所述的氧化石墨烯尺寸优选为小于500nm。所述的离心收集是指：用移液器吸头缓慢搅拌充分裂解细胞，离心收集裂解后得到的氧化石墨烯-核酸-核酸结合蛋白复合物，超纯水洗复合物3次。所述的超纯水洗是指：在1.5mLEP管中用超纯水重悬复合物并上下颠倒清洗，不打散复合物。所述的蛋白变性液为6～8M尿素，10～100mMTris-HCl，pH7.0～8.0。所述的重悬于蛋白变性液，具体为：300-500μL蛋白变性液重悬复合物于1.5mLEP管中。所述的超声处理，优选为在200W-400W环境下超声6～10s。所述的核酸结合蛋白，其采用但不限于以下方式鉴定得到：采用本专利技术的方法提取293T细胞的核酸结合蛋白，并应用LC-MSMS的方法对核酸结合蛋白进行鉴定。技术效果与现有技术相比，本专利技术可以快速有效的富集到细胞内的核酸包括DNA和RNA，通过对核酸的富集从而提取核酸结合蛋白，本专利技术操作简单，成本低，耗时短的优点，可用于从各种细胞系中提取核酸结合蛋白。更具体来说，本专利技术涉及利用纳米材料氧化石墨烯可以吸附核酸的属性，通过富集核酸进而从细胞中富集到核酸结合蛋白。该方法可用于所有动物细胞核酸结合蛋白的提取，结合定量蛋白质组学技术有助于疾病发生发展相关的核酸结合蛋白的发现和研究。附图说明图1为本方法的流程示意图；图2为氧化石墨烯-核酸-核酸结合蛋白复合物；图中：A为氧化石墨烯-核酸-核酸结合蛋白复合物照片；B为共聚焦荧光显微镜分析复合物结果，其中DIPA为核酸染料；C为三种纳米材料羧基化石墨烯cG为，氧化石墨烯GO为，羧基化碳纳米管cCNT为RNA提取效率的比较；其中方法A为本专利技术使用的方法，方法B为文献中使用的方法；氧化石墨烯提取RNA的效率最高；D为三种纳米材料DNA提取效率的比较；氧化石墨烯提取DNA的效率最高；E为五种纳米材料石墨烯G为，羧基化石墨烯cG为，氧化石墨烯GO为，羧基化碳纳米管cCNT为，高羧基化碳纳米管hcCNT为在RNA提取效率中的比较，其中氧化石墨烯的对RNA提取效率最高；F为用石墨烯，氧化石墨烯和碳纳米管分别从5x106个细胞中提取的核酸结合蛋白的质量；图3为SDS-PAGE并结合蛋白银染的结果；图中：a为全细胞裂解液；b为提取的核酸结合蛋白；c为阴性对照：从经过核酸酶处理过后的全细胞裂解液中提取出的蛋白；图4为LC-MSMS对提取的核酸结合蛋白的鉴定结果；图中：A为为打散和不打散的方法清洗复合物分别鉴定到的核酸结合蛋白的数量；B为为蛋白免疫印迹检测DNA结合蛋白组蛋白H3和RNA结合蛋白PTBP1分别在全细胞裂解液，提取的核酸结合蛋白，核酸结合蛋白提取后细胞上清液中的含量。具体实施方式如图1所示，本实施例包括以下步骤：步骤1、将待测细胞加入含有氧化石墨烯的细胞裂解液中进行裂解：1.1)配制含有氧化石墨烯的细胞裂解液，细胞裂解液成分为250mMSDS，根据所要裂解的细胞的数量，取相应量的氧化石墨烯并溶解于细胞裂解液中，使其终浓度为1mg/mL，一般5x106个细胞需要500μg氧化石墨烯。1.2)将细胞重悬于20μLPBS中后缓慢加入到细胞裂解液中裂解细胞，并用移液器吸头缓慢搅拌充分裂解细胞。所述的待测细胞为293T细胞系。1.3)在4℃、20000g环境下离心5分钟，弃上清。1.4)收集氧化石墨烯-核酸-核酸结合蛋白复合物，如图2A所示，并用超纯水上下颠倒洗复合物3次，不打散复合物。其结果如图2B所示本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于氧化石墨烯的核酸结合蛋白提取方法，其特征在于，通过将待测细胞加入含有氧化石墨烯的细胞裂解液中进行裂解，离心收集裂解后得到的氧化石墨烯‑核酸‑核酸结合蛋白复合物并将其重悬于蛋白变性液中并超声处理，收集上清液中的核酸结合蛋白即得。

【技术特征摘要】
1.一种基于氧化石墨烯的核酸结合蛋白提取方法，其特征在于，通过将待测细胞加入含有氧化石墨烯的细胞裂解液中进行裂解，离心收集裂解后得到的氧化石墨烯-核酸-核酸结合蛋白复合物并将其重悬于蛋白变性液中并超声处理，收集上清液中的核酸结合蛋白即得。2.根据权利要求1所述的核酸结合蛋白提取方法，其特征是，所述的待测细胞为所有动物细胞。3.根据权利要求1或2所述的核酸结合蛋白提取方法，其特征是，所述的待测细胞重悬于PBS中为5x106个细胞重悬于20μLPBS。4.根据权利要求1所述的核酸结合蛋白提取方法，其特征是，所述的细胞裂解液，具体为：每裂解5x106个细胞，溶解500μg氧化石墨烯于500μL250mMSDS中。5.根据权利要求1所述的核酸结合蛋白提取方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖华，尚志，曹成喜，樊柳荫，张岩，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海,31