一种用于鉴定印度南瓜‘银辉三号’杂交种子纯度的分子标记及其应用制造技术

技术编号:15757349 阅读:97 留言:0更新日期:2017-07-05 03:38
本发明专利技术公开了一种用于鉴定印度南瓜‘银辉三号’杂交种子纯度的分子标记及其应用,属于分子育种技术领域。用于PCR扩增分子标记的引物对为Yinhui3‑F和Yinhui3‑R,Yinhui3‑F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示,Yinhui3‑R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示;通过引物对能够同时特异性扩增出91bp序列和85bp序列的杂交F

A method for identification of pumpkin in India \silver three 'molecular markers in hybrid seed purity and its application

The invention discloses a method for identification of pumpkin in India \silver three 'application of molecular marker and hybrid seed purity, which belongs to the technical field of molecular breeding. Molecular markers for PCR amplification of primer pairs for Yinhui3 F and Yinhui3 R, Yinhui3 F nucleotide sequence of SEQ ID NO.3, Yinhui3 R nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO.4; by primer specific hybridization can also amplify 91bp and 85bp sequences F

【技术实现步骤摘要】
一种用于鉴定印度南瓜‘银辉三号’杂交种子纯度的分子标记及其应用
本专利技术涉及一种用于鉴定印度南瓜‘银辉三号’杂交种子纯度的分子标记及其应用,属于分子育种

技术介绍
南瓜(2n=2x=40)(Cucurbitaspp)属于葫芦科(Cucurbitaceae)南瓜属(Cucurbitaspp.),一年生蔓生草本植物,是重要的世界性蔬菜。南瓜用途多样,具有很高的营养和药用价值,深受广大消费者喜爱。近年来,育种家根据广大消费者的需要,培育出多个南瓜新品种,本专利技术人所在南瓜育种实验室培育的印度南瓜‘银辉三号’杂交种产量高、籽粒洁白,具有出籽率高、抗病害的特点,在生产中深受种植者喜爱。‘银辉三号’为母本‘088’和父本‘9-6’杂交一代南瓜品种,制种时需摘除母本所有雄花花蕾,取父本花粉人工授粉到母本雌花花柱。授粉期间母本雄花摘除不及时不彻底,其花粉可能落到母本雌花柱头上产生自交种子,从而出现假杂种。‘银辉三号’种子不纯会严重影响南瓜的产量和品质,造成经济损失,因此,需在销售前做种子纯度鉴定,符合国家对杂交种子的纯度要求方可出售。常用的种子纯度鉴定可分为以下三种方法:1)形态标记鉴定我国南瓜一代杂交种遗传纯度鉴定早期多采用传统的形态特征特性鉴定,即植株长到一定时期后,观察杂交种的各种性状并与标准株相比较分析其相似性,从而鉴定杂交种的纯度。但该方法需要进行田间种植,费时费力,鉴定结果还会受到外界环境影响,因此鉴定效率低、准确性差。2)同工酶鉴定Schwartz等(1960)最早用同工酶方法检测杂交种子纯度和预测杂种优势,随后同工酶方法已成功地用于葫芦科作物杂种纯度的鉴定工作(黄永红等,1994;陈清华等,1998;马国斌等,1999;刘永庆等,2005)。同工酶分析技术虽然手段较为简单,适合杂种大群体鉴别,但具有组织器官及发育的特异性,且使用的同工酶和特异蛋白质数量有限,可标记的位点较少,因而应用受到限制。3)分子标记鉴定分子标记鉴定以DNA多态性为基础的遗传标记,可稳定遗传,分子标记可开发数量几乎是无限的,且检测手段简单、迅速。随着分子生物学技术的发展,DNA分子标记技术已有数十种,广泛应用于遗传育种和杂种纯度鉴定等方面。常用于葫芦科作物种子纯度检测的几种分子标记为:基于分子杂交检测的RFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphism,限制性片段长度多态性);基于PCR的RAPD(RandomAmplifiedPolymorphismofDNA,随机扩增多态性),SSR(LengthPolymorphismofSimpleSequenceRepeat,简单序列重复多态性),AFLP(AmplifiedFragmentLengthPolymorphism,扩增片段长度多态性)。大量种子纯度检测实践中发现:RFLP检测存在周期长,成本高,需用到放射性元素等问题,因此在品种纯度鉴定应用上受到一定的影响;RAPD技术对反应条件十分敏感,须使RAPD反应标准化、程序化,须建立每种作物品种种子纯度的不同RAPD检测技术操作规程;AFLP技术试剂盒价格昂贵,检测成本高,操作过程较为复杂,并且对DNA提取纯度和内切酶质量要求严格,技术较难掌握,其应用受到一定的限制;SSR扩增重复性好,结果稳定可靠,操作简单,用时较短,仅需要微量组织亦能有效分析鉴别。近年来印度南瓜‘银辉三号’以其优良品质和高产性状广受种植者好评,推广面积日益扩大,种子需求量随之增大。为了防止人工制种过程出现假杂种,急需成熟的种子纯度鉴定方法。现有技术中仍未建立对印度南瓜‘银辉三号’杂交种子纯度鉴定方法,尽快建立一套稳定可靠、简单快速的印度南瓜‘银辉三号’种子纯度检验方法成为当务之急。
技术实现思路
印度南瓜‘银辉三号’杂交优势明显,为解决印度南瓜‘银辉三号’这个杂交品种在做杂交种子的时候出现母本自交的现象,进而形成假杂种,种子不纯严重影响南瓜的产量和品质,从而造成经济损失,需在销售前做种子纯度鉴定。本专利技术提供了一种用于鉴定印度南瓜‘银辉三号’杂交种子纯度的分子标记及其引物,无需等待南瓜单株成长至果实成熟期再观察形态特征,在幼苗期即可提取DNA,根据扩增片段区分真假杂种,有效鉴定杂种纯度,采用的技术方案如下:本专利技术的目的在于提供一种用于鉴定印度南瓜‘银辉三号’杂交种子纯度的SSR分子标记Yinhui3,用于PCR扩增分子标记的引物对为Yinhui3-F和Yinhui3-R,其中上游引物Yinhui3-F的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示,下游引物Yinhui3-R的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示;通过所述引物对Yinhui3-F和Yinhui3-R能够同时特异性扩增出SEQIDNO.1所示的91bp核苷酸序列和SEQIDNO.2所示的85bp核苷酸序列的杂交F1单株则为真杂交种,缺少SEQIDNO.1和SEQIDNO.2中任意一条核苷酸序列的杂交F1单株则为假杂交种。本专利技术还提供了一种所述SSR分子标记Yinhui3及其引物对Yinhui3-F和Yinhui3-R在南瓜杂交种子纯度鉴定和辅助鉴定、南瓜杂交种子纯度筛选、南瓜分子标记辅助育种中的应用。本专利技术还提供了一种印度南瓜‘银辉三号’杂交种子纯度的鉴定方法,包括如下步骤:1)提取母本‘088’、父本‘9-6’和‘银辉三号’的单株幼苗基因组DNA;2)分别以步骤1)所得母本‘088’、父本‘9-6’和‘银辉三号’的南瓜基因组DNA为模板,利用SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示的上游引物Yinhui3-F和下游引物Yinhui3-R进行PCR扩增反应,获得PCR产物;3)对步骤2)所得的PCR产物进行凝胶电泳;4)对电泳结果进行分析,同时具有核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的长度为91bp条带和SEQIDNO.2所示的长度为85bp条带的杂交F1单株为真杂交种,缺少上述任意一条条带的杂交F1单株为假杂种。优选地,所述PCR扩增反应的扩增程序为:94℃5分钟;94℃45秒,60℃30秒,72℃30秒,35个循环;72℃10分钟。优选地,每10μL所述PCR扩增反应的体系中包括1×TaqBuffer,1.5mmol/LMgCl2,200μmol/LdNTPs,引物各0.2μmol/L,30ng模板DNA,0.5UTaqDNAPolymerase。本专利技术所述SEQIDNO.1所示的核苷酸序列包括91个核苷酸,该片段为父本‘9-6’的SSR引物扩增片段(91bp),所述SEQIDNO.2所示的核苷酸序列包括85个核苷酸,该片段为母本‘088’的SSR引物扩增片段(85bp)。本专利技术所述凝胶电泳为8%非变性聚丙烯酞胺凝胶电泳。本专利技术‘银辉三号’为母本‘088’和父本‘9-6’杂交一代南瓜品种,本专利技术所述的杂交F1单株均指‘银辉三号’的单株。本专利技术有益效果:1、银辉3号杂交优势明显,但是在做杂交种子的时候可能会因为人工授粉等原因,母本自交的现象出现假杂种,种子不纯严重影响南瓜的产量和品质,从而造成经济损失,需在销售前做种子纯度鉴定。为了区分真假杂种,鉴定杂种纯度,本申请开发了一种可以用于鉴定南瓜‘银辉三号’杂交种子纯度的分子标记及引物,该分子标记和引物能够有效鉴定本文档来自技高网
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一种用于鉴定印度南瓜‘银辉三号’杂交种子纯度的分子标记及其应用

【技术保护点】
一种用于鉴定印度南瓜‘银辉三号’杂交种子纯度的SSR分子标记Yinhui3,其特征在于,用于PCR扩增分子标记的引物对为Yinhui3‑F和Yinhui3‑R,其中上游引物Yinhui3‑F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示,下游引物Yinhui3‑R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示;通过所述引物对Yinhui3‑F和Yinhui3‑R能够同时特异性扩增出SEQ ID NO.1所示的91bp核苷酸序列和SEQ ID NO.2所示的85bp核苷酸序列的杂交F

【技术特征摘要】
1.一种用于鉴定印度南瓜‘银辉三号’杂交种子纯度的SSR分子标记Yinhui3,其特征在于,用于PCR扩增分子标记的引物对为Yinhui3-F和Yinhui3-R,其中上游引物Yinhui3-F的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示,下游引物Yinhui3-R的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示;通过所述引物对Yinhui3-F和Yinhui3-R能够同时特异性扩增出SEQIDNO.1所示的91bp核苷酸序列和SEQIDNO.2所示的85bp核苷酸序列的杂交F1单株则为真杂交种,缺少SEQIDNO.1和SEQIDNO.2中任意一条核苷酸序列的杂交F1单株则为假杂交种。2.权利要求1所述SSR分子标记Yinhui3及其引物对Yinhui3-F和Yinhui3-R在南瓜杂交种子纯度鉴定和辅助鉴定、南瓜杂交种子纯度筛选、南瓜分子标记辅助育种中的应用。3.一种印度南瓜‘银辉三号’杂交种子纯度的鉴定方法,其特征在于,包括如下步骤:1)提取母本‘088’、父本‘9-6’和‘银辉三号’的单株幼苗基因...

【专利技术属性】
技术研发人员:屈淑平王云莉闫春冬王洋洋徐文龙
申请(专利权)人:东北农业大学
类型:发明
国别省市:黑龙江,23

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