一种利用适配体分子开关检测黄曲霉毒素B1的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用适配体分子开关检测黄曲霉毒素B1的方法。本发明专利技术首先保护一种核酸适配体，如序列表的序列1所示。本发明专利技术还保护一种探针，是在所述单链DNA分子的5'末端标记荧光基团FAM，3’末端标记淬灭基团BHQ1得到的。本发明专利技术还保护一种检测黄曲霉毒素B1的方法，包括如下步骤：将以上任一所述探针与待测样本共孵育，如果与共孵育前相比共孵育后的荧光强度下降、说明待测样本中含有黄曲霉毒素B1。本发明专利技术具有如下的优点和效果：采用核酸适配体作为亲和配体用于检测黄曲霉毒素B1，可以发挥适配体的优点，这种核酸适配体分子开关可产生荧光降低的响应，可实现对黄曲霉毒素B1的快速灵敏检测。

Method for detecting aflatoxin B1 by using aptamer molecular switch

The present invention discloses a method for detecting aflatoxin B1 by using aptamer molecular switches. The present invention first protects a nucleic acid aptamer, such as the sequence 1 of the ordered list. The invention also protects a probe obtained by labeling a quenching group BHQ1 at the 5'end of the single stranded DNA molecule to mark a fluorescent group FAM, 3'. The invention is a protection method for detection of aflatoxin B1, which includes the following steps: more than any of the probe and the samples were incubated, and if incubated decreased, compared after incubation of fluorescence intensity before that samples containing aflatoxin B1. The invention has the advantages and effects are as follows: using aptamers as affinity ligands for the detection of aflatoxin B1, can play the advantages of aptamers, this aptamer molecular switch can produce fluorescence response decreases, can realize rapid sensitive detection of aflatoxin B1.

【技术实现步骤摘要】
一种利用适配体分子开关检测黄曲霉毒素B1的方法
本专利技术涉及一种利用适配体分子开关检测黄曲霉毒素B1的方法。
技术介绍
黄曲霉毒素是一类具有很强毒性的真菌毒素,由黄曲霉、寄生曲霉等产生，是一类重要的天然污染物。在几种黄曲霉毒素中，黄曲霉毒素B1毒性最强，对人和动物具有致肝癌作用，是1类致癌物。动物和人通过食用黄曲霉毒素污染的食品造成黄曲霉毒素的摄入和暴露，进而对健康产生重要影响。灵敏快速检测黄曲霉毒素在食品安全、质量监控、环境分析等方面具有重要的意义，有着广泛的需求。目前常用的检测黄曲霉毒素分析方法主要包括色谱法、质谱法、免疫分析传感等方法。色谱和质谱分析要求使用昂贵的大型仪器、检测和运行维护成本成本高、操作复杂、对操作人员也有较高的要求。免疫传感分析利用可特异性识别黄曲霉毒素的免疫抗体构建可检测黄曲霉毒素的传感分析方法。免疫抗体的制备复杂昂贵，稳定性较差，容易变性。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种利用适配体分子开关检测黄曲霉毒素B1的方法。本专利技术首先保护一种单链DNA分子(核酸适配体)，如序列表的序列1所示。本专利技术还保护所述DNA分子在结合黄曲霉毒素B1中的应用。本专利技术还保护所述DNA分子在检测黄曲霉毒素B1中的应用。本专利技术还保护所述DNA分子在制备用于检测黄曲霉毒素B1的试剂盒中的应用。本专利技术还保护一种探针(探针甲)，是在所述单链DNA分子的5'末端标记荧光基团，3’末端标记淬灭基团得到的。本专利技术还保护一种探针(探针乙)，是在所述单链DNA分子的5'末端标记荧光基团荧光素FAM(fluorescein)，3’末端标记淬灭基团BHQ1(Blackholequencher1)得到的。本专利技术还保护以上任一所述探针在检测黄曲霉毒素B1中的应用。本专利技术还保护一种检测黄曲霉毒素B1的方法，包括如下步骤：将以上任一所述探针与待测样本共孵育，如果与共孵育前相比共孵育后的荧光强度下降、说明待测样本中含有黄曲霉毒素B1。当所述探针为探针乙时，所述荧光强度为“激发波长为485纳米，发射波长为528纳米”下的荧光强度。所述共孵育的时间为15分钟。所述共孵育具体可为室温静置孵育15分钟。所述共孵育是在缓冲体系中进行的。所述缓冲体系为pH值为8.0。所述缓冲体系的组成具体如下：10mMHEPES、20mMMgCl2、120mMNaCl、0.1％(体积百分含量)Tween20，余量为水。所述探针、所述待测样本和所述缓冲体系组成反应体系。所述反应体系中，所述探针的浓度为25nM。所述待测样本可为固态样品或液态样品，例如白酒。本专利技术还保护以上任一所述探针在制备用于检测黄曲霉毒素B1的试剂盒中的应用。核酸适配体是一类可选择性与目标分子作用的单链核酸分子，可以通过化学合成的方法制备，合成成本低，具有较高的稳定性，容易引入功能团，如荧光染料分子等。本专利技术发展了一种利用核酸适配体分子开关检测黄曲霉毒素B1的荧光分析方法。核酸适配体的5'末端标记荧光基团FAM，3’末端标记淬灭基团BHQ1,它与目标分子结合后，FAM的荧光强度明显降低,从而实现对黄曲霉毒素B1的检测。本专利技术具有如下的优点和效果：采用核酸适配体作为亲和配体用于检测黄曲霉毒素B1，可以发挥适配体的优点，这种核酸适配体分子开关可产生荧光降低的响应，可实现对黄曲霉毒素B1的快速灵敏检测。附图说明图1为利用核酸适配体分子开关检测黄曲霉毒素B1的结果。图2为核酸适配体分子开关检测黄曲霉毒素B1的选择性的结果。图3为利用核酸适配体分子开关检测稀释白酒样品中添加的黄曲霉毒素B1的结果。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。核酸适配体由上海生工生物工程有限公司合成。缓冲溶液：10mMHEPES、20mMMgCl2、120mMNaCl、0.1％(体积百分含量)Tween20，余量为水，pH8.0。HEPES全称为4-羟乙基哌嗪乙磺酸。黄曲霉毒素B1，英文名为AflatoxinB1，简写为AFB1，分子式为C17H12O6，CAS号为1162-65-8，青岛普瑞邦生物工程有限公司，产品目录号为STD#1042。赭曲霉毒素A：青岛普瑞邦生物工程有限公司，产品目录号为STD#5012。赭曲霉毒素B：青岛普瑞邦生物工程有限公司，产品目录号为STD#5021。伏马毒素B1：青岛普瑞邦生物工程有限公司，产品目录号为STD#2031。伏马毒素B2：青岛普瑞邦生物工程有限公司，产品目录号为STD#2041。玉米赤霉烯酮：青岛普瑞邦生物工程有限公司，产品目录号为STD#4012。实施例1、特异探针的制备1、人工合成序列表的序列1所示的单链DNA分子(核酸适配体)。序列表的序列1：5’-CGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCG-3’。2、在步骤1制备的核酸适配体的5'末端标记荧光基团FAM，3’末端标记淬灭基团BHQ1，得到特异探针。实施例2、利用核酸适配体分子开关检测黄曲霉毒素B1将实施例1制备的特异探针、缓冲溶液和黄曲霉毒素B1混匀(初始体系中，探针的浓度为25nM，黄曲霉毒素B1的浓度见图1的横坐标)，然后室温静置孵育15分钟，然后检测FAM的荧光强度变化(激发波长485纳米，发射波长528纳米)。每种浓度设置2个重复处理，结果取平均值。结果见图1。随着黄曲霉毒素B1浓度的增加，荧光强度逐渐降低，检测限为3.9nM。实施例3、利用核酸适配体分子开关检测黄曲霉毒素B1的选择性考察将实施例1制备的特异探针、缓冲溶液和待测样本混匀(初始体系中，探针的浓度为25nM，设置不加入待测样本的空白对照)，然后室温静置孵育15分钟，然后检测FAM的荧光强度变化(激发波长485纳米，发射波长528纳米)。a组：空白对照。b组：待测样本为黄曲霉毒素B1，初始体系中黄曲霉毒素B1的浓度为200nM。c组：待测样本为赭曲霉毒素A，初始体系中赭曲霉毒素A的浓度为1μM。d组：待测样本为赭曲霉毒素B，初始体系中赭曲霉毒素B的浓度为1μM。e组：待测样本为伏马毒素B1，初始体系中伏马毒素B1的浓度为1μM。f组：待测样本为伏马毒素B2，初始体系中伏马毒素B2的浓度为1μM。g组：待测样本为玉米赤霉烯酮，初始体系中玉米赤霉烯酮的浓度为1μM。每组设置2个重复处理，结果取平均值。结果见图2。图2中，a至g依次对应a组至g组。待测样本为黄曲霉毒素B1时，与空白对照相比荧光强度明显下降。待测样本为其他物质时，与空白对照相比荧光强度均无显著变化。实施例4、利用核酸适配体分子开关检测稀释白酒样品中添加的黄曲霉毒素B1取白酒样品(北京顺鑫农业股份有限公司的牛栏山二锅头清香型白酒,度数46％)，用缓冲溶液稀释至10倍体积,然后加入实施例1制备的特异探针和黄曲霉毒素B1混匀(初始体系中，探针的浓度为25nM，黄曲霉毒素B1的浓度见图3的横坐标)，然后室温静置孵育15分钟，然后检测FAM的荧光强度变化(激发波长485纳米，发射波长528纳米)。每种浓度设置2个重复处理，结果取平均值。结果见图3。随着黄曲霉毒素B1浓度的增加，荧光强本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种单链DNA分子，如序列表的序列1所示。

【技术特征摘要】
1.一种单链DNA分子，如序列表的序列1所示。2.一种探针，是在权利要求1所述单链DNA分子的5'末端标记荧光基团，3’末端标记淬灭基团得到的。3.一种探针，是在权利要求1所述单链DNA分子的5'末端标记荧光基团FAM，3’末端标记淬灭基团BHQ1得到的。4.权利要求2或3所述探针在检测黄曲霉毒素B1中的应用。5.一种检测黄曲霉毒素B1的方法，包括如下步骤：将权利要求2或3所述探针与待测样本共孵育，如果与共孵育前相比共孵育后的荧光强度下降...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵强，王超，
申请(专利权)人：中国科学院生态环境研究中心，
类型：发明
国别省市：北京,11