一种制备分泌IL‑12CD19CAR‑T细胞的方法技术

本发明专利技术涉及免疫学和分子生物学T淋巴细胞技术领域，尤其涉及一种制备分泌IL‑12 CD19 CAR‑T细胞的方法。具体步骤为：制备一种抗CD19嵌合抗原受体和分泌IL‑12的质粒，将这两种质粒、转座酶质粒与电转试剂混合，加入PBMC细胞中电转染，然后采用偶联CD3/CD/28抗体的磁珠富集CD3阳性T细胞，筛选并培养扩增转染后的T细胞制备分泌IL‑12 CD19 CAR‑T细胞。本发明专利技术采用第三代CAR，使用PiggyBac转座子系统电转染提高了转染效率和转基因表达效率，同时，采用人自身EF1α启动子制备抗CD19嵌合抗原受体，使CAR基因在人体内长时间持续表达；本发明专利技术所制备的T细胞还能分泌IL‑12，利于T细胞和NK细胞的活化。因此，本发明专利技术提供了一种制备效率更高、工艺相对简单、可塑性高、安全性好的分泌IL‑12的CD19 CAR‑T细胞制备方法。

A method for preparation of IL 12CD19CAR secretion of T cells

The present invention relates to the technical field of immunology and molecular biology of T lymphocytes, particularly relates to a method for preparing IL 12 CD19 secreted CAR T cells. Specific steps: preparation of plasmid an anti CD19 chimeric antigen receptor and the secretion of IL 12, the two kinds of plasmids, transposase plasmid and electroporation reagents, joined into PBMC cells by electroporation, and then using CD3/CD/28 antibodies conjugated to magnetic beads enrichment of CD3 positive T cells, screening and cultivation of amplification of T cells after transfection by secreting IL 12 CD19 CAR T cells. The invention adopts the third generation of CAR, using PiggyBac transposon system electroporation transfection efficiency is improved and the efficiency of transgene expression, at the same time, using the human EF1 promoter in preparation of anti CD19 chimeric antigen receptor CAR gene expression in the human body for a long time; the T cells can secrete IL by 12 for T, the activation of cells and NK cells. Therefore, the invention provides a preparation of high efficiency, simple process, high plasticity, good safety secretion of IL 12 CD19 CAR T cell preparation method.

【技术实现步骤摘要】
一种制备分泌IL-12CD19CAR-T细胞的方法
本专利技术涉及免疫学和分子生物学，T淋巴细胞
，尤其涉及一种利用PiggyBac系统制备分泌IL-12CD19CAR-T细胞的方法。
技术介绍
白血病俗称“血癌”，是一类起源于造血干细胞的恶性克隆性疾病。克隆性白血病细胞不断增生，浸润其他非造血组织和器官，并抑制正常造血功能。在中国每年大约有上万名患者被诊断为B系急性淋巴白血病(B-ALL)，美国大约有80％的人急性白血病都是B-ALL，其中80％的B-ALL患者被一线化化疗所缓解，但仍有60％的B-ALL会复发。由于白血病分型和预后分层复杂，如按起病的缓急可分为急、慢性白血病，按病变细胞种类分类，包括髓系和淋巴系，淋巴系又包括T和B细胞系，因此没有千篇一律的治疗方法。治疗这些患者的一个方法是基因修饰T细胞以通过嵌合抗原受体(ChimericAntigenReceptor,CAR)的表达，靶向并结合在肿瘤细胞上表达的抗原，将信号传递至细胞内，引起T细胞增殖活化，从而靶向杀伤肿瘤细胞。CAR分子主要包括胞外抗原结合区、穿膜区和胞内信号区。第一代CAR由scFV、穿膜区、CD3ζ链或FcεRIγ链组成，但表现出有限的扩增性和持久性，以及有限的抗肿瘤效应。第二、三代CAR则在第一代的基础上分别引入一个或者两个共刺激信号域(如CD28、4-1BB)，显著提高了CAR-T细胞的增值能力和抗肿瘤作用，延长了CAR-T细胞在体内的持续存在时间。CD19作为B-ALL的一个理想治疗靶点，在治疗难治性B细胞恶性肿瘤获得了较高的缓解率。目前CD19CAR-T在治疗儿童和成人复发B-ALL，慢性淋巴细胞白血病(CLL)，和B细胞非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)表现出稳定高效的抗肿瘤效力。在Peter研究小组中，给复发难治的CLL病人输注自体含有4-1BB共刺激信号的CD19-CAR-T细胞后，观察到持续超过两年的缓解，大多数病人低剂量CD19CAR-T细胞输注后，观察到CAR-T细胞在体内大量增殖、伴随着肿瘤溶解和正常B细胞的缺乏。靶向CD19分子的CAR-T细胞在针对难治、复发的B细胞来源的血液肿瘤的治疗上，获得了传统疗法无法达到的临床疗效，完全缓解率(CR)普遍达到了80％，有些临床试验甚至高达100％，成为当下肿瘤免疫治疗中最为引人关注的领域。不过也暴露出在CAR-T细胞持久性较差、抗原逃逸导致肿瘤复发及安全性隐患等问题：(1)存活时间短。存活时间的长短已被证明与疗效密切相关，确保回输后的CAR-T细胞在患者体内的存活时间成为关键；(2)易复发。CAR-T细胞体内存活时间不够长，抗原丢失产生免疫逃逸机制，最终导致复发；(3)制备成功率不高。常用逆转录病毒系统来制备CAR-T，能有效感染宿主细胞，但其装载量有限，且重组病毒颗粒制备工艺较复杂。并且患者由于进行过多种治疗，会使其T细胞活性过低，体外培养无法保证回输CAR-T的量。IL-12是细胞免疫应答过程中的关键调节因子，具有重要的生物活性。IL-12能够激活自然杀伤细胞、巨噬细胞和T细胞，促进其分泌大量的IFN-γ，以抑制并杀伤肿瘤细胞，专利号201510979423.7中利用含IL-12/突变型CD62L融合基因的慢病毒修饰抗肿瘤T细胞，可以增加T细胞对肿瘤的毒杀效应，然而该方法使用的慢病毒载体感染T细胞，存在一定的致癌内险，同时所设计的T细胞没有特异性，具有一定的毒副作用。为了进一步改良CAR的设计，建立一种克服上述缺陷的制备CD19CAR-T细胞的方法，特提出本专利技术。针对CAR-T细胞存活时间短、血液肿瘤易复发的问题，本专利技术在CD19CAR-T所涉及的CAR表达载体上加入内部核糖体进入位点(IRES)和IL-12基因序列，从而使设计的CD19CART能够表达分泌IL-12，增强肿瘤的杀伤效应；针对CD19CAR-T细胞制备成功率不高的问题，本专利技术使用PiggyBac转座子系统，制备工艺相对简单，可塑性高，通过与其他功能蛋白融合或改变转座酶的功能区域等，不仅能够改变转座酶的活性和作用方式，最重要的是可以提高外源基因转座的靶向性；同时，本专利技术避免使用病毒载体，降低了致癌风险。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了一种制备分泌IL-12CD19CAR-T细胞的方法，该方法简单易行，分泌IL-12CD19CAR-T细胞有效性更好，安全性更高。本专利技术的技术方案是这样实现的：一种制备分泌IL-12CD19CAR-T细胞的方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)PBMC细胞制备；(2)制备表达抗CD19嵌合抗原受体和分泌IL-12的质粒；(3)将步骤(2)中制备的表达抗CD19嵌合抗原受体和分泌IL-12的质粒、转座酶质粒和Amaxa电转试剂盒中的电转试剂混合，加入PBMC细胞中进行电转染，然后采用偶联CD3/CD/28抗体的磁珠富集CD3阳性T细胞，筛选并培养扩增转染后的T细胞制备分泌IL-12CD19CAR-T细胞。进一步地，所述PBMC细胞是由外周血中制得，PBMC细胞制备具体步骤为：(1)用抗凝管采集外周血，边采集边摇晃使外周血与抗凝剂充分混合；(2)外周血细胞与淋巴细胞分离液等体积混合，离心，吸取离心后的白膜层细胞；(3)将得到的白膜层细胞与PBS或者无血清细胞培养基1640混合后离心，沉淀即为所述PBMC细胞，重复三遍。进一步的，所述表达抗CD19嵌合抗原受体和分泌IL-12的质粒是利用PiggyBac-transposon载体依次串联人启动子、CSF2RA嵌合受体信号肽、胞膜外抗原结合区、铰链区、胞内信号传导区、T2A短肽连接的抗性基因puromycin和IRES连接的hIL-12f制备而成的。进一步地，所述胞膜外抗原结合区为用于结合CD19蛋白的CD19单链抗体(scFv)，依次串联c-myc表位标记、CD8Hinge嵌合受体铰链、CD8Transmembrane嵌合受体跨膜区。进一步地，所述胞内信号传导区为CD28-4-1BB-ITAM，CD28和4-1BB为嵌合受体共刺激分子。本专利技术的有益效果：相对于现有技术，本专利技术优选采用第三代CAR，使用PiggyBac转座子系统提高了转染效率和转基因的表达效率；采用人自身的EF1α启动子，使CAR基因能够在人体内长时间持续表达；此外，本专利技术所制备的T细胞还能分泌IL-12，有利于T细胞和NK细胞的活化，增强了T细胞的抗肿瘤能力。可见，本专利技术所述的分泌IL-12CD19CAR-T细胞的制备将给淋巴细胞白血病的免疫治疗提供可靠的保障。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为使用的PB-CD19CAR-T-BBZ-puro表达载体的基因结构图；图2为分泌IL-12CD19CAR-T细胞和CD19CAR-T细胞中CAR表达率的对比结果图；图3为分泌IL-12CD19CAR-T细胞和CD19CAR-T细胞，分别与Raji人淋巴瘤细胞和K562白血病细胞系共培养后，细胞毒杀伤能力检测的对比图。图4本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备分泌IL‑12CD19CAR‑T细胞的方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)PBMC细胞制备；(2)制备抗CD19嵌合抗原受体和分泌IL‑12的质粒；(3)将步骤(2)中制备的抗CD19嵌合抗原受体和分泌IL‑12质粒、转座酶质粒和Amaxa电转试剂盒中的电转试剂混合，加入PBMC细胞中进行电转染，然后采用偶联CD3/CD/28抗体的磁珠富集CD3阳性T细胞，筛选并培养扩增转染后的T细胞制备分泌IL‑12CD19CAR‑T细胞。

【技术特征摘要】
1.一种制备分泌IL-12CD19CAR-T细胞的方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)PBMC细胞制备；(2)制备抗CD19嵌合抗原受体和分泌IL-12的质粒；(3)将步骤(2)中制备的抗CD19嵌合抗原受体和分泌IL-12质粒、转座酶质粒和Amaxa电转试剂盒中的电转试剂混合，加入PBMC细胞中进行电转染，然后采用偶联CD3/CD/28抗体的磁珠富集CD3阳性T细胞，筛选并培养扩增转染后的T细胞制备分泌IL-12CD19CAR-T细胞。2.根据权利要求1所述的一种制备分泌IL-12CD19CAR-T细胞的方法，其特征在于：所述PBMC细胞是由外周血中制得，PBMC细胞制备具体步骤为：(1)用抗凝管采集外周血，边采集边摇晃使外周血与抗凝剂充分混合；(2)外周血细胞与淋巴细胞分离液等体积混合，离心，吸取离心后的白膜层细胞；(3)将得到的白膜层细胞与PBS或者无血清细胞培养基1640混合后离心，沉淀即为...

【专利技术属性】
技术研发人员：尚小云，
申请(专利权)人：尚小云，
类型：发明
国别省市：湖北,42