本发明专利技术为一种淡水鱼细菌性败血症免疫防治二联灭活疫苗及规模化生产技术。本发明专利技术采用发病鱼体中分离得到强毒株，规模化生产制成灭活疫苗，以注射、浸泡等方法进行免疫接种，对鲫鱼、草鱼等淡水养殖鱼类进行免疫，可达到良好的防病效果；同时克服单一灭活苗只针对一种病原菌的缺点，提供一种二联疫苗可一次施用同时抵御两种病原菌感染，提高免疫的效果，疫苗通过浸泡、注射或拌和饲料投喂均可方便施用。
Two inactivated inactivated vaccine of Vivtorinox and Aeromonas hydrophila and large-scale preparation technology
The invention relates to a two inactivated inactivated vaccine and a large-scale production technique for freshwater fish bacterial septicemia. The invention adopts the virulent isolated disease in fish, the scale of production made of inactivated vaccine, vaccination by injection and immersion method, immunization of carp, grass carp and other freshwater fishes, can reach good effect of prevention; at the same time to overcome the single inactivated vaccine against only one pathogen defect, provide a two vaccine can be applied once at the same time against two kinds of pathogenic bacteria infection, improve the immune effect of vaccine by injection and immersion or mixing feed can be conveniently applied.
【技术实现步骤摘要】
一种维氏、嗜水气单胞菌二联灭活疫苗及规模化制备技术
本专利技术属水产养殖病害免疫防治
，具体涉及一种淡水鱼细菌性败血症免疫防治二联灭活疫苗及规模化制备技术。
技术介绍
淡水鱼类细菌性出血病又称细菌出血性败血症是危害淡水养殖鱼类最为严重的传染病之一，危害的鱼类主要有草、鲢、鳙、鲫、鲤、鲂、鲮、鳗、鳜等鱼类，给淡水养殖业造成严重损失(达到30％以上)。该病病原主要是气单胞菌属维氏气单胞菌)和嗜水气单胞菌，他们引起的细菌性败血症病害占80％以上，为淡水鱼类最常见的致病菌。一般采用消毒剂和化药抗生素等进行防治疗，易污染水体，并引起水产品药物残留问题。疫苗能刺激动鱼体产生免疫防御病原的攻击，亦能增强机体抗不良应激的能力，作为病害防控措施之一。国内近十年来水产疫苗研制进展较快，但疫苗规模化制备方法较为缺少，基本为实验室制备技术，目前迫切需要可产业化生产的水产疫苗生产技术。
技术实现思路
为了解决现有技术中的诸多问题，本专利技术提供了一种维氏、嗜水气单胞菌二联灭活疫苗及规模化制备技术。本专利技术通过如下的技术方案来实现：一种维氏、嗜水气单胞菌二联灭活疫苗包括以下组分：维氏气单胞菌培养物灭活液和嗜水气单胞菌培养物灭活液。优选的，所述的维氏、嗜水气单胞菌二联灭活疫苗中，维氏气单胞菌培养物灭活液占50％，其中细菌浓度不少于25×108cfu/ml；嗜水气单胞菌培养物灭活液占50％，其中细菌浓度不少于25×108cfu/ml。本专利技术还提供了一种维氏、嗜水气单胞菌二联灭活疫苗的规模化制备技术，包括如下步骤：将维氏气单胞菌培养物灭活液，嗜水气单胞菌培养物灭活液按1:1比例混合搅拌均匀，无菌灌装，制的维氏、嗜水气单胞菌二联灭活疫苗成品。优选的，所述维氏、嗜水气单胞菌二联灭活疫苗的规模化制备技术包括如下步骤：1)一级种子制备：维氏气单胞菌、嗜水气单胞菌菌株分别接种营养琼脂平板，28℃培养，24小时，挑菌苔接种营养肉汤培养基，28℃，摇瓶培养18-20小时，制备一级种子液各3L；2)二级种子制备：将两个一级种子液各自接种50L种子罐，培养基为30L产毒素培养基，28℃，30L/min的通气量，搅拌通气培养12-14小时，制备二级种子液；3)制苗菌液培养：将二级种子液各自接种500L发酵罐，培养基为300L产毒素培养基，28℃，175L/min的通气量，搅拌通气培养12-14小时，得到制备疫苗的菌液，活菌数50×108cfu/ml以上为合格；4)菌液灭活：培养物菌液分别移至500L灭活罐，两种菌液分别加入0.30％甲醛液，37℃，灭活24小时，进行无菌检验和甲醛残留检验合格，得到维氏气单胞菌培养物灭活液和嗜水气单胞菌培养物灭活液；5)配苗分装：分别将两种细菌培养物灭活液按1：1的比例输入1000L配苗罐，罐内混合液搅拌均匀。无菌条件下进行分装、轧盖、得到维氏、嗜水气单胞菌二联灭活疫苗成品。本专利技术中疫苗制备方法是通过一、二级种子液逐级放大至500L发酵罐培养，转至500灭活罐灭活，再转至1000L配苗罐混匀、配苗、分装得到疫苗成品，是一种工厂化生产技术。技术成熟、可大批量生产，每批次可生产疫苗成品700L，可供至少350万尾鱼注射免疫使用，质量稳定可控，成本低，优于小规模实验室制备技术，可产业化生产。疫苗可通过注射、浸泡等方式施用，免疫鲫鱼、草鱼等淡水养殖鱼类效果良好，注射免疫保护率达到80％以上，浸泡免疫保护率超过50％，可有效预防淡水鱼细菌性败血症，减少抗生素等化药的使用，提高水产品质量安全，减少水体污染，增加渔民收入。同时克服单一灭活苗只针对一种病原菌的缺点，提供一种二联疫苗可一次施用同时抵御两种病原菌感染，提高免疫的效果，疫苗通过浸泡、注射或拌和饲料投喂均可方便施用。具体实施方式下面通过具体的实施例对本专利技术的技术方案进行详细的说明，但是本专利技术的范围不受这些实施例的限制。本实施例提供了一种维氏、嗜水气单胞菌二联灭活疫苗的规模化制备技术，包括如下步骤：1、一级种子液制备把保存在冰箱的菌种(维氏气单胞菌株、嗜水气单胞菌株)取出，接种营养琼脂(培养基配方见附录)，28℃培养24小时，挑菌苔接营养琼脂，28℃培养24小时，接种营养肉汤(培养基配方见附录)300ml/瓶，10瓶，放摇床200r/min，28℃，培养18小时，得到3L一级种子液。本实施例选择的菌种为：维氏气单胞菌菌株LYK090702分离自患病鲢鱼肾脏，嗜水气单胞菌菌株YYK090901分离自患病鳙鱼肾脏，目前菌种均保存于中国水产科学研究院珠江水产研究所。2、二级种子液制备按配方配制的30L产毒素培养基(培养基配方见附录)，加入到50L种子发酵罐，121℃,20分钟灭菌，培养基冷却后，将3L一级种子液接种种子发酵罐，28℃，通气量30L/min，250r/min，搅拌培养12小时，得到二级液体种子液。3、制备疫苗的菌液培养按配方配制的300L产毒素培养基，加入到500L发酵罐，121℃，20分钟灭菌，培养基冷却后，将纯粹及合格的二级种子液接入发酵罐，发酵罐内培养液温度为28℃，无菌空气流量175L/min，200r/min培养菌液12小时，培养结束后无菌采样，进行纯粹和活菌数检测(参照《中华人民共和国兽药典》二00五年版第三部)，活菌数需达到50×108CFU/mL以上为合格菌液。2.4、灭活将合格菌液通过管道输送到灭活罐，无菌操作加入甲醛液，甲醛液最终浓度为0.30％，以37℃灭活，灭活24小时，期间每隔4小时低速搅拌一次，灭活好的菌液冷却至1～5℃之间，进行无菌检验和甲醛残留检验(参照《中华人民共和国兽药典》二0一0年版)。2.5、配苗与分装分别将两种细菌的合格灭活液按1：1的比例输入1000L配苗罐，罐内混合液搅拌均匀。无菌条件下进行分装、轧盖，得到维氏、嗜水气单胞菌二联灭活疫苗成品。经测定，培养菌液纯粹检验合格，维氏气单胞菌培养液活菌数为106×108cfu/ml，嗜水气单胞菌培养液活菌数为117×108cfu/ml，均高于50×108cfu/ml；灭活菌液无菌检验合格，所得的淡水鱼气单胞菌二联灭活疫苗中，嗜水气单胞菌培养物灭活液占50％，维氏气单胞菌培养物灭活液，占50％，疫苗成品甲醛液残留(平均为0.182％)符合国家标准。本专利技术制备的维氏、嗜水气单胞菌二联灭活疫苗的免疫效果如下所述：将健康鲫鱼(20-30g/尾)随机分成三组，每组100尾。第一组为注射免疫组，每尾腹腔注射实施例一所制备的二联灭活疫苗0.2ml；第二组为浸泡免疫组，先将实验鱼在1％NaCL溶液中浸泡3-5min，然后在10倍稀释的二联疫苗液中充气浸泡10-15min；第三组为对照组。水温为22-26℃。在免疫28d后，分别用2倍LD50剂量的维氏气单胞菌株LYK090702(6×108cfu/ml)和嗜水气单胞菌株YYK090901(3×107cfu/ml)腹腔注射感染每组各50尾试验鱼，每尾0.2ml，并饲养观察7天，记录各组试验鱼的发病和死亡情况。将健康草鱼(15-20g/尾)200尾，随机分成二组，每一组100尾。第一组注射疫苗免疫组，每尾腹腔注射实施例一所制备的二联灭活疫苗0.2ml；第二组对照组。水温为22-26℃。在免疫28d后，分别用2倍LD50剂量的维氏气单胞菌株LYK0907本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种维氏、嗜水气单胞菌二联灭活疫苗，其特征在于，包括以下组分：维氏气单胞菌培养物灭活液和嗜水气单胞菌培养物灭活液。
【技术特征摘要】
1.一种维氏、嗜水气单胞菌二联灭活疫苗，其特征在于，包括以下组分：维氏气单胞菌培养物灭活液和嗜水气单胞菌培养物灭活液。2.根据权利要求1所述的哈氏、溶藻弧菌二联灭活疫苗，其特征在于：所述的维氏、嗜水气单胞菌二联灭活疫苗中，维氏气单胞菌培养物灭活液占50％，其中细菌浓度不少于25×108cfu/ml；嗜水气单胞菌培养物灭活液占50％，其中细菌浓度不少于25×108cfu/ml。3.一种制备权利要求1或2所述的维氏、嗜水气单胞菌二联灭活疫苗的规模化制备技术，包括如下步骤：将维氏气单胞菌培养物灭活液，嗜水气单胞菌培养物灭活液按1:1比例混合搅拌均匀，无菌灌装，制的维氏、嗜水气单胞菌二联灭活疫苗成品。4.根据权利要求3所述的维氏、嗜水气单胞菌二联灭活疫苗的规模化制备技术，其特征在于，包括如下步骤：1)一级种子制备：维氏气单胞菌、嗜水气单胞菌菌株分别接种营养琼脂平板，28℃培养，24小时，挑菌苔...
【专利技术属性】
技术研发人员：陶家发，赖迎迢，任燕，孙承文，江小燕，罗霞，赵长臣，巩华，刘春花，黄志斌，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院珠江水产研究所，
类型：发明
国别省市：广东,44
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