葡聚糖的制备制造技术

本发明专利技术涉及包含β‑葡聚糖的组合物。更具体地说，本发明专利技术涉及生产可溶性β‑葡聚糖的方法。

【技术实现步骤摘要】
葡聚糖的制备本申请是申请日为2007年6月15日、申请号为200780029944.X、专利技术名称为“葡聚糖的制备”的专利技术专利申请的分案申请。专利技术背景本申请要求2006年6月15日提交的美国序列号60／813,971、题为葡聚糖的制备的权益。本专利技术涉及包含β-葡聚糖的组合物。更具体地说，本专利技术涉及可溶性β-葡聚糖组合物及其在干细胞动员中的用途。葡聚糖往往被描述为葡萄糖的聚合物，并衍生自酵母、细菌、真菌和植物，例如燕麦或大麦。已知含β(1-3)-连接的吡喃葡萄糖主链的葡聚糖具有生物学活性，尤其是，已经表明它们调节免疫系统，更近期地，介导造血干细胞和祖细胞(HSPC)的动员。各种癌症的治疗日益涉及减少细胞数的治疗，包括高剂量化疗或放射疗法。这些治疗使患者的白细胞数下降，抑制骨髓造血活性，并增加他们感染和／或出血的风险。因此，接受减少细胞数的治疗的患者也必须接受治疗，以重新恢复骨髓功能(造血作用)。尽管在干细胞动员和技术方面取得进展，高达20-25％的患者表现出不良的动员，并不能进行自体移植。PGGβ-葡聚糖是可溶性酵母衍生的多糖，先前已经表现出介导造血干细胞和祖细胞(HSPC)的动员。专利技术概述在本专利技术中，酵母被培养、收获和纯化，生成基本不含污染有挥发性有机化合物(VOCs)的微粒β-葡聚糖。通过使酵母细胞或其片段经受去除宿主细胞杂质的一系列的碱、表面活性剂和酸提取，制备微粒β-葡聚糖。经以上工艺或经现有工艺方法生产的微粒β-葡聚糖在升高的温度和压力下可溶解于酸性溶液。然后，澄清和先后采用疏水相互作用的层析(HIC)、凝胶渗透层析(GPC)纯化所生成的可溶性β-葡聚糖。作为药剂，以较高剂量给予可溶性β-葡聚糖，而无增加的或实际上减少的可观察到的副作用或不利结果。图的简述图1是生产微粒β-葡聚糖的方法的示意图。图2是生产可溶性β-葡聚糖的方法的示意图。专利技术详述微粒β-葡聚糖图1是从酵母生产不溶的或微粒β-葡聚糖的方法10的概况，它包括步骤12-22。在步骤12中，酵母培养基典型地在摇瓶或发酵桶中生长。用于本专利技术的酵母株可为任何株，其实例包括酿酒酵母(Saccharomyces(S.)cerevisiae)、德尔布酵母(S.delbrueckii)、罗斯酵母(S.rosei)、小椭圆酵母(S.microellipsodes)、卡尔酵母(S.carlsbergensis)、二孢酵母(S.bisporus)、发酵性酵母(S.fermentati)、鲁酵母(S.rouxii)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces(K.)lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)，多孢克鲁维酵母(K.polysporus)、白假丝酵母(Candida(C.)albicans).阴道假丝酵母(C.cloacae)、热带假丝酵母(C.tropicalis)、产朊假丝酵母(C.utilis)、温奇汉逊酵母(Hansenula(H.)wingei)、arni汉逊酵母(H.arni)、亨利汉逊酵母(H.henricii、美国汉逊酵母(H.americana)、加拿大汉逊酵母(H.canadiensis)、碎囊汉逊酵母(H.capsulata)、多形汉逊酵母(H.polymorpha)、克鲁弗毕赤酵母(Pichia(P.)kluyveri)、巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、多形毕赤酵母(P.polymorpha)、罗丹毕赤酵母(P.rhodanesis)、奥默毕赤酵母(P.ohmeri)、牛球拟酵母(Torulopsis(T.)bovina)和光滑球拟酵母(T.glabrata)。在批量生产的一个实施方案中，从酵母培养开始，经摇动烧瓶培养基逐步扩大到250-L规模的生产发酵桶。酵母在富含维生素，例如叶酸、肌醇、烟酸、泛酸(钙和钠盐)、吡哆醇HCl和胸腺嘧啶HCl和来自化合物例如氯化铁六水合物；氯化锌；氯化钙二水合物；钼酸；硫酸铜五水合物和硼酸的微量金属的葡萄糖-硫酸铵培养基中生长。在约0.02％浓度时，也可加入消泡剂，例如防沫剂(Antifoam)204。以补料分批培养方式(fedbatchmode)将生产培养基维持在葡萄糖限制下。在种子发酵期间，在接种生产发酵桶之前，定时取样，测量培养基的光密度。在生产发酵期间，仍定时取样，以测量培养基的光密度。在发酵结束时，取样测量光密度、干重量和微生物纯度。如果需要，可通过提高培养基pH到至少11.5或经离心培养基以从生长介质中分离细胞，终止发酵。此外，可根据想要得到的经纯化的β-葡聚糖的规格和形式，采取分裂或破碎酵母细胞的各个步骤。可采用任何已知的化学、酶或机械方法，或它们的任何组合，分裂或破碎酵母细胞。在步骤14，收获含β-葡聚糖的酵母细胞。当批量生产β-葡聚糖时，典型地采用连续流式离心收获酵母细胞。步骤16表示用一种或多种碱溶液、表面活性剂或它们的组合初步提取酵母细胞。例如，适用的碱溶液是0.1M-5MNaOH。适用的表面活性剂包括，例如，辛基硫葡糖苷、LubrolPX、TritonX-100、月桂基硫酸钠(SDS)、NonidetP-40、吐温20等。也可采用离子型(阴离子、阳离子、两性)表面活性剂(例如，磺酸烷基酯、苯扎氯铵等)和非离子型表面活性剂(例如，聚氧乙烯氢化篦麻油、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯、聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯、聚氧乙烯甘油脂肪酸酯、聚乙二醇脂肪酸酯、聚氧乙烯烷基苯基醚等)。表面活性剂的浓度会有所不同，并部分地取决于所用的表面活性剂。酵母细胞材料可被提取一次或多次。提取通常在介于约70℃-约90℃的温度下进行。根据温度、所用试剂及其浓度，每次提取的持续时间介于约30分钟-约3小时之间。在每次提取后，采用离心或连续流式离心收集含有β-葡聚糖的固相，并为后继步骤而再悬浮。离心期间，在液相中除去已溶解的污染物，同时使β-葡聚糖保存于不溶的细胞壁材料中。在一个实施方案中，进行四次提取。在第一次提取中，使已收获的酵母细胞与1.0MNaOH混合，并加热至90℃约60分钟。第二次提取是碱／表面活性剂提取，借此，使不溶材料再悬浮于0.1MNaOH和约0.5％-0.6％TritonX-100中，并加热至90℃约120分钟。第三次提取类似于第二次提取，除了TritonX-100浓度为约0.05％，和持续时间缩短至约60分钟之外。在第四次提取中，使不溶材料再悬浮于约0.5％Triton-X100中，并加热至75℃约60分钟。碱和／或表面活性剂提取物溶解并去除某些无关酵母细胞材料。碱溶液水解蛋白、核酸、甘露聚糖和脂质。表面活性剂促进脂质和其它疏水杂质的去除，这为生成改进的β-葡聚糖产物提供额外的优点。先前的纯化程序生成含有微量挥发性有机化合物(VOCs)的β-葡聚糖。在先研究已经表明，脂肪作为脂肪酸释放，再快速分解为各种VOCs，生成VOCs。大部分情况下，检测出的量不足以造成危害，但，给予人或其它动物的产物基本不含任何VOCs显然是有益的。需氧和厌氧生长产生的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的脂肪含量介于约3％-约8％。脂肪含量随酵母的生长条件而变化。表1提供酿酒酵母的典型脂本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生产具有免疫刺激性质的可溶性β‑葡聚糖的方法，该方法包括：向微粒β‑葡聚糖和酸的悬液施加35 PSI压力；和以足以形成可溶性β‑葡聚糖的时间加热该悬液至135℃；其中所述可溶性β‑葡聚糖具有介于120,000 Da和205,000 Da之间的平均分子量。

【技术特征摘要】
2006.06.15 US 60/8139711.一种生产具有免疫刺激性质的可溶性β-葡聚糖的方法，该方法包括：向微粒β-葡聚糖和酸的悬液施加35PSI压力；和以足以形成可溶性β-葡聚糖的时间加热该悬液至135℃；其中所述可溶性β-葡聚糖具有介于120,000Da和205,000Da之间的平均分子量。2.权利要求1的方法，其还包括：澄清可溶性β-葡聚糖。3.权利要求2的方法，其中的可溶性β-葡聚糖经离心、过滤或它们的组合澄清。4.权利要求1的方法，其中的悬液在基本除去所有氧气的容器中。5.权利要求4的方法，其中的氧气通过用氮气吹洗容器除去。6.权利要求1的方法，其还包括：根据分子量分离进入各流分的可溶性β-葡聚糖。7.权利要求6的方法，其中的可溶性β-葡聚糖经层析法分离。8.权利要求1的方法，其中的酸是乙酸。9.一种包含具有免疫刺激性质的未衍化的、可溶性β-葡聚糖的组合物，它可以以至多6mg/...

【专利技术属性】
技术研发人员：A梅吉，J罗尔克，杨仁德，
申请(专利权)人：生物高聚物工程公司DBA生物治疗公司，
类型：发明
国别省市：美国,US