一种苹果树腐烂病生防菌剂的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种苹果树腐烂病生防菌剂的制备方法，将可以直接以苹果树腐烂病病原菌菌丝体为营养进行生长、繁殖，同时能够诱导自身产生多种可降解病原菌细胞壁的胞外水解酶，且可以长期定殖于苹果树腐烂病病斑处的微白黄链霉菌Actin‑1经活化、产孢，制备成孢子悬液，然后将其接种到液体种子培养基中发酵制得发酵种子液，最后将发酵种子液接种于固体发酵培养基经固体发酵制成孢子原粉，然后与紫外保护剂、分散剂、载体等助剂科学筛选、复配，制得一种防治效果好、效率高、复发率低、适应环境能力强、稳定强、不易产生抗药性等多重优点的生防菌剂，是生物防治的首选，对提高苹果树腐烂病等果蔬病原菌的防治效果、防止病原菌复发、保护环境具有重要意义。

An Apple Tree Canker biocontrol agent preparation method

The invention discloses a preparation method of Apple Tree Canker biocontrol agent, can directly to the Apple Tree Canker pathogen mycelium nutrition growth and reproduction, but also induce extracellular hydrolase itself produces a variety of pathogenic bacteria can degrade the cell wall, and micro white roseoflavus Actin long during the period of colonization on Apple Tree Canker lesion at 1 after activation, sporulation, spore suspension was prepared, and then inoculated into liquid seed medium fermentation fermentation liquid seed, the fermented seeds were inoculated in solid fermentation medium made by solid fermentation of spore powder, and then the UV protective agent, dispersing agent, carrier additives such as scientific screening, compound, prepared a good prevention effect, high efficiency, low recurrence rate, strong ability to adapt to the environment, stable and strong, not easy to produce drug resistance and multiple advantages of students Biocontrol agent, biological control is preferred to improve the Apple Tree Canker and pathogenic bacteria control effect, prevent the recurrence of pathogenic bacteria, protect the environment is of great significance.

【技术实现步骤摘要】
一种苹果树腐烂病生防菌剂的制备方法
本专利技术涉及生防菌剂的制备，具体涉及一种苹果树腐烂病生防菌剂的制备方法。
技术介绍
苹果树腐烂病(ValsamaliMiyabeetYamada)俗称烂皮病、臭皮病，是由黑腐皮壳属(Valsaceratosperma)引起的北方苹果树重要的病害。该病主要危害3年生以上的结果树，造成树势衰弱、枝干枯死、死树甚至毁园。该病症状主要以溃疡型为主。溃疡型在早春树干、树皮上出现红褐色、水渍状、微隆起、圆至长圆形病斑，质地松软，易撕裂，手压容易凹陷，流出黄褐色汁液，有酒糟味。后期干缩下陷，病部边缘裂缝，有明显的小黑点即分生孢子器，潮湿时小黑点涌出橘黄色卷须分生孢子。一般3-5月份侵染，7-8月开始发病，早春为发病高峰期。苹果树腐烂病的防治一直以化学农药防治为主，但化学农药长期并大量的使用已经造成环境污染、生态失衡、人畜中毒及杀伤有益微生物等严重问题。目前生物防治越来越受到广大研究者和果农的认可，因此开发安全性高、环境兼容性好、有效性持久的生物防治剂成为植物真菌病害综合防治的热点研究方向。目前，已经公开的防治苹果树腐烂病的生防菌剂涉及细菌和真菌的较多，比如：中国专利CN105331545A公开了一种防治苹果树腐烂病的菌株、微生物菌剂及其制备方法。所述菌株61239已于2015年7月1日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCM2015420。生防真菌来源于自然界中，无污染、无公害、无残留，对人畜无毒副作用，无论是对苹果树还是对人体、生态环境都相当的安全，可运用于苹果树的任何生育期，特别是休眠期，不产生任何抗性，可彻底控制和根治苹果腐烂病。实验证明，对苹果树腐烂病菌特异性强，控制效果好，平均防效在95％以上。所述菌株61239对苹果腐烂病菌具有显著的抑菌和杀菌活性，特别是能以苹果树体上的老翘皮、各个剪锯口处死组织上的纤维素和木质素为养分，长期定殖存活于苹果树上，既能预防新病斑的产生，又能防止原有老疤的复发，可持久地控制苹果腐烂病菌，从而达到彻底控制和根治苹果腐烂病的目的。中国专利CN105284902A公开了一种防治苹果树腐烂病生防菌发酵液制备方法；所述菌株SL17和SL18均为枯草芽孢杆菌，已于2015年保藏于山西省农业科学院植物保护研究所菌种库，菌株SL17保藏编号为SAASIPPLF17，菌株SL18保藏编号为SAASIPPLF18。该专利对所述菌株进行液体培养并浓缩后制得发酵液药剂及发酵液膏剂，有效防治苹果树腐烂病，治愈率约80％，促进伤口愈合，伤口愈合平均宽度为9.46cm2，病斑复发率为4.21％。中国专利CN102851225A公开了一株微嗜酸寡养单胞菌及其在苹果树腐烂病生防剂中的应用，所述菌株BJ1保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCNO:2011475，实验表明，微嗜酸寡养单胞菌BJ1在苹果离体枝条防效实验中。发酵滤液对苹果树腐烂病的防效达94.97％，在2-3年生苹果树幼树防效实验中也达70％以上，防效稳定，对环境友好，发酵工艺简单，生产成本低廉；但是，细菌和真菌产生的抑菌性生物活性物质种类少，产量低，活性低，持效期短，防病效果不理想。放线菌对靶标菌发挥生防作用一般通过两种途径：在寄主体外通过抗生作用、竞争作用、捕食和重寄生作用，导致病原菌的致病性及侵染效率降低；放线菌也可在寄主植物组织内，诱发其产生抗性或者产生抑菌物质，影响病原菌的生长、繁殖，最后导致其死亡。链霉菌是一种放线菌，其产生的抗生素、胞外酶等抗真菌活性物质比益生细菌和真菌所产生的活性物质种类更多、活性更强，用其孢子和菌丝制成的活细胞制剂无毒、无害、无残留、不伤害非靶标微生物、与环境兼容性好、防病持效期长，且产孢量大、孢子抗逆性强、易于制成活细胞制剂如孢子粉剂、种衣剂、菌丝体培养物等以及便于生产和运输保存。被广泛应用于农业病害的生物防治。目前，公开的防治苹果树腐烂病的链霉菌较少，比如：中国专利CN104673723A公开了一种极长链霉菌株SL01(StreptomyceslongissimusSL01)及由该菌株制备的微生物菌剂(发酵液及发酵滤液)。该专利技术还公开了两种微生物菌剂在防治苹果树腐烂病中的应用。采用不同处理方法涂抹菌株SL01发酵液及发酵滤液发现，离体枝条和果实的防效均达到90％，与药剂对照甲基硫菌灵达到同一水平；2012年大田试验中，刮病斑后涂抹SL01菌剂防治效果100％，划线后涂抹防效为58％；2013年大田试验中，刮病斑后涂抹SL01菌剂防治效果97.8％，超过甲基硫菌灵药剂对照的防效(84.6％)，划线后涂抹防效为64.4％，均可有效降低为防治苹果树腐烂病而大量施用化学农药所造成的对生态环境的破坏，具有很好的生态和社会效益，开发应用前景广阔。中国专利CN101822272B公开了一种灰黄链霉菌在生物防治植物病害中的应用。该应用具体为灰黄链霉菌(Streptomycesgriseoflavus)NMG6-3-9CGMCCNo.3441在生物防治植物病害中的应用。该菌株对苜蓿根腐病病原菌具有非常好的拮抗作用，能够用于生物防治苜蓿根腐病及其它多种植物病害，在生物防治植物病害领域具有广阔的应用前景。该专利技术为苜蓿根腐病的生物防治奠定基础，进而为该病生防放线菌制剂的研制与应用提供科学依据。张清明等研究了伍卡尔链霉菌发酵滤液对苹果树腐烂病的防效达70％。上述公开的链霉菌防病效果仍不很理想，且防病机理同大多数细菌和真菌一样，主要是通过代谢产生抗生素、抗菌肽等抗菌物质产生拮抗效应抑制病原菌的生长和繁殖，防病效果不彻底，不能根治苹果树腐烂病。研究表明：病原菌的细胞壁以几丁质、纤维素为骨架，以β-1,3-葡聚糖及蛋白质为主要填充物。放线菌是抗生素的主要产生菌，生防放线菌除通过抗生素的拮抗作用抑制病原菌外，在常规诱导物的作用下，产生几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶等胞外水解酶的放线菌对病原菌有抑菌作用，如果能直接以苹果树腐烂病病原菌菌丝体为营养进行生长、繁殖，并且诱导生防菌自身产生多种可降解病原菌细胞壁的胞外水解酶，通过协同酶溶作用使病原菌细胞崩解，不仅可直接杀死病原菌，而且可长期定殖在苹果树腐烂病斑处，彻底防止苹果树腐烂病的发生，提高防病效果，有效防止腐烂病复发。综上，制备一种可以直接以苹果树腐烂病病原菌菌丝体为营养进行生长、繁殖，同时诱导生防菌自身产生多种可降解病原菌细胞壁的胞外水解酶以提高防病效果，防止苹果树腐烂病复发的苹果树腐烂病生防菌剂是本领域技术人员的期盼。
技术实现思路
本专利技术所解决的技术问题是克服现有苹果树腐烂病生防菌剂的缺陷，将可以直接以苹果树腐烂病病原菌菌丝体为营养进行生长、繁殖，同时能够诱导自身产生多种可降解病原菌细胞壁的胞外水解酶，且可以长期定殖于苹果树腐烂病病斑处的微白黄链霉菌Actin-1经活化、产孢，制备成孢子悬液，然后将其接种到液体种子培养基中发酵制得到发酵种子液，最后将发酵种子液接种于固体发酵培养基经固体发酵制成孢子原粉，然后与紫外保护剂、分散剂、载体等助剂科学筛选、复配，制得一种有效提高防病效果，防止苹果树腐烂病复发的生防菌剂。为了达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种苹果树腐烂病生防菌剂的制备方法，包括如下步骤：1)发酵种子液的制备本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种苹果树腐烂病生防菌剂的制备方法，包括如下步骤：1)发酵种子液的制备：将微白黄链霉菌Actin‑1菌种划线接种于高氏一号琼脂培养基斜面上，28‑32℃培养6‑8天至产孢；然后向斜面加入5mL无菌水，用灭菌接种针将孢子刮下，加入无菌水中，震荡混匀得孢子悬液；将所述孢子悬液按接种量0.8‑1.2％(v/v)接种到液体种子培养基中，28‑32℃，180‑220r/min，摇瓶培养46‑50h即得发酵种子液；2)固体发酵培养基的制备：按照固体发酵培养基配方，先用部分水将K

【技术特征摘要】
1.一种苹果树腐烂病生防菌剂的制备方法，包括如下步骤：1)发酵种子液的制备：将微白黄链霉菌Actin-1菌种划线接种于高氏一号琼脂培养基斜面上，28-32℃培养6-8天至产孢；然后向斜面加入5mL无菌水，用灭菌接种针将孢子刮下，加入无菌水中，震荡混匀得孢子悬液；将所述孢子悬液按接种量0.8-1.2％(v/v)接种到液体种子培养基中，28-32℃，180-220r/min，摇瓶培养46-50h即得发酵种子液；2)固体发酵培养基的制备：按照固体发酵培养基配方，先用部分水将K2HPO4、MgSO4·7H2O溶解，然后与其它原料混匀，分装至灭菌袋，于121℃灭菌45min，冷却至35℃；平铺于长70cm，宽50cm，深5cm灭菌后的曲盘中；3)固体发酵：按体积质量比10％的接种量将步骤1)发酵种子液接种至步骤2)盛有固体发酵培养基的曲盘中；底层用灭菌的报纸覆盖，上层用灭菌的麻包覆盖，移入曲房；于温度28-32℃、湿度64-66％培养22-26h后将麻包、报纸掀开，翻耙，然后依次将报纸、麻包覆盖，每22-26h重复操作一次；同样条件下继续培养至94-98h后移至烘干房，于35℃晾干，粉碎、过120目筛即得微白黄链霉菌Actin-1孢子原粉；4)混匀：将步骤3)得到的微白黄链霉菌Actin-1孢子原粉与载体、紫外保护剂、分散剂按质量比53-61:36-44:1-3:0.8-1.2均匀混合即得苹果树腐烂病生防菌剂；所述微白黄链霉菌Actin-1保藏编号为CGMCCNO.13927，分类命名为微白黄链霉菌Streptomycesalbidoflavus；步骤1)所述液体种子培养基质量...

【专利技术属性】
技术研发人员：李玲娣，王灵敏，孙振娜，严立恩，李学辉，王江，王楠，
申请(专利权)人：陕西枫丹百丽生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：陕西,61