一种猪肺炎支原体培养基及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种猪肺炎支原体培养基及其制备方法。本发明专利技术所述的猪肺炎支原体培养基由基础培养基和辅助培养基组成，其中：基础培养基主要成分有Hank′s液、乳蛋白水解物、酵母提取物、牛心提取物，可以通过高压蒸汽灭菌方式除菌，大大地减少了过滤除菌带来的污染风险；辅助培养基由猪血清、精氨酸、半胱氨酸、酚红溶液、青霉素等组成，猪血清通过钴照射除菌，其余成分过滤除菌后与灭活的猪血清混合。本发明专利技术培养基培养猪肺炎支原体兔化弱毒株的滴度达到10

Mycoplasma pneumoniae culture medium for pig and preparation method thereof

The invention relates to a Mycoplasma pneumoniae culture medium and a preparation method thereof. The pig mycoplasma culture medium by basic culture medium and culture medium composition, auxiliary including: basic medium main components include Hank 's liquid, milk protein hydrolysate, yeast extract, beef extract, by high pressure steam sterilization sterilization, greatly reducing the risk of contamination caused by auxiliary filtration; medium from pig serum, arginine, cysteine, phenol red solution and penicillin, pig serum by cobalt irradiation sterilization, the remainder after filtration with Inactivated Porcine Serum mixture. The culture medium of the invention has a titer of 10 of the attenuated strain of Mycoplasma pneumoniae Mycoplasma

【技术实现步骤摘要】
一种猪肺炎支原体培养基及其制备方法
本专利技术属于兽医生物学
，涉及一种猪肺炎支原体培养基及其制备方法。技术背景猪支原体肺炎又称猪喘气病，是由猪肺炎支原体引起的一种慢性呼吸道传染病。临床上以咳嗽、气喘和肺部典型的“虾肉”样病变为特征，发病率高，死亡率低。猪肺炎支原体可以通过抑制先天性和后天性肺脏免疫导致多杀性巴氏杆菌等上呼吸道共生菌在肺脏增殖并促使疾病发生，它还可以与猪繁殖与呼吸综合征病毒等病毒混合感染，加重疾病的发生。尽管猪肺炎支原体并非引起肺脏疾病的唯一病原，但是它作为能引起肺脏疾病病原体的增强子而著称，因此成为造成经济损失的一个主要原因。猪支原体肺炎等疾病有效的预防和控制方法是为猪只提供优良的生活环境，如保证圈舍内的空气清新、通风条件良好、环境温度适宜及猪只的数量适宜，猪场实施科学严谨的管理措施，如控制猪的进出流动、仔猪早期断奶等。但是这些有效控制方法在国内猪场很难做到。目前猪场常使用的方法是药物治疗和疫苗防控。不管是猪肺炎支原体灭活疫苗还是弱毒活疫苗，无细胞培养都需要培养基。猪肺炎支原体由于基因组小，基因数量有限，从而导致生物合成途径缺乏，需要从生长环境中获取糖、氨基酸、嘌呤、嘧啶和膜成分，这就要求猪肺炎支原体培养基中含有这些成分。从猪肺炎支原体分离、鉴定至今，已有不同配方的培养基，从最早的煮沸猪肺组织灭活细胞培养基、猪肺埋块无细胞培养基，到后来的Friis培养基、江苏农科院的KM2培养基、兽医生物制品制造及检验规程中的猪肺炎支原体培养基，都可以培养出猪肺炎支原体，但是培养的滴度难以超过109CCU，血清用量也都比较高。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种营养丰富、培养滴度高、生产成本低且适合猪肺炎支原体(兔化弱毒株)快速生长的高效培养基。本专利技术提供的培养基可使猪肺炎支原体(兔化弱毒株)的菌液滴度达到109-1010CCU，培养时间仅需40～48h，且所需猪血清浓度不超过10％，最优组合猪血清仅需8％。培养时间大大缩短可以减少陈旧菌、老龄菌的产生，从而减少陈旧菌、老龄菌代谢产生的有害物质，并且减少生产耗能；培养基中猪血清的用量大大降低，一方面有利于减少由猪血清带来的过敏应激反应，另一方面有利于生产成本的大幅降低。本专利技术的另一目的是提供猪肺炎支原体(兔化弱毒株)高效培养基的制备方法。本专利技术的技术方案1.一种猪肺炎支原体培养基，由基础培养基包括20×Hank′s25～35ml、酵母提取物1～5g、乳蛋白水解物0.5～3g、牛心提取物5～12g、去离子水770～870ml，辅助培养基包括5％精氨酸溶液1～5ml、5％半胱氨酸溶液1～5ml、5％辅酶Ι1～5ml、10万U/ml青霉素5～10ml和灭活的健康猪血清80～200ml组成。2.本专利技术所述的一种猪肺炎支原体培养基，其特征在于它能培养猪肺炎支原体兔化弱毒株，并且培养的CCU滴度可以达到109～1010，所需猪血清浓度不超过10％。3.本专利技术所述的一种高效猪肺炎支原体培养基，其特征在于20×Hank′s液包括：20×Hank′s1：NaCl12～16g、MgSO4·7H2O0.1g～0.5g、KCl0.4～1.0g、MgCl2·6H2O0.1～0.5g、CaCl20.2～0.5g、去离子水100ml；20×Hank′s2：Na2HPO4·12H2O0.1～0.4g、KH2PO40.1～0.35g、葡萄糖1～5g、1％酚红溶液2～4ml、去离子水96～98ml。4.本专利技术所述的一种猪肺炎支原体培养基，其特征在于制备步骤如下：(1)基础培养基的配制：按配比量取20×Hank′s125～35ml、20×Hank′s225～35ml，称取酵母提取物1～5g、乳蛋白水解物0.5～3g、牛心提取物5～12g、去离子水770～870ml，搅拌均匀，10MNaOH调pH至7.2～7.4，115℃高压灭菌20min；(2)辅助培养基的配制：按配比量取过滤除菌的5％精氨酸溶液1～5ml、5％半胱氨酸溶液1～5ml、5％辅酶Ι1～5ml、10万U/ml青霉素5～10ml、56℃灭活的猪血清80～200ml。5.本专利技术所述的一种猪肺炎支原体培养基，其特征在于它还包括高效猪肺炎支原体固体培养基，配制方法是在上述基础培养中加入0.8～1.5％琼脂糖。本专利技术具体实施方式1.培养基的组分一种猪肺炎支原体(兔化弱毒株)高效培养基，其特征在于由基础培养基和辅助培养基组成。其中：基础培养基的主要成分包括20×Hank′s25～35ml、酵母提取物1～5g、乳蛋白水解物0.5～3g、牛心提取物5～12g、去离子水770～870ml；辅助培养基的主要成分包括5％精氨酸溶液1～5ml、5％半胱氨酸溶液1～5ml、5％辅酶Ι1～5ml、10万U/ml青霉素5～10ml和灭活的健康猪血清80～200ml。2.培养基的制备方法一种猪肺炎支原体(兔化弱毒株)高效培养基，其特征在于制备方法包括以下步骤：(1)20×Hank′s液的制备：20×Hank′s液包括20×Hank′s1和20×Hank′s2。1)20×Hank′s1：按配比称取NaCl12～16g、MgSO4·7H2O0.1～0.5g、KCl0.4～1.0g、MgCl2·6H2O0.1～0.5g、CaCl20.2～0.5g，去离子水100ml，配制时CaCl2单独溶解，其余各成分逐一溶解，最后混合；2)20×Hank′s2：按配比称取Na2HPO4·12H2O0.1～0.4g、KH2PO40.1～0.35g、葡萄糖1～5g、去离子水96～98ml，逐一溶解后加入1％酚红溶液2-4ml。(2)基础培养基的制备：按配比量取20×Hank′s125～35ml、20×Hank′s225～35ml于770～870ml去离子水中，按配比逐一称取酵母提取物1-5g、乳蛋白水解物0.5-3g、牛心提取物5～12g，搅拌均匀，10MNaOH调pH至7.2～7.4，115℃高压灭菌20min，4℃保存备用。(3)辅助培养基的制备：1)5％精氨酸溶液：称取L-精氨酸5g溶解于100ml去离子水，0.22μm滤器过滤除菌，分装，-20℃保存备用。2)5％半胱氨酸溶液：称取L-半胱氨酸5g溶解于100ml去离子水，0.22μm滤器过滤除菌，分装，-20℃保存备用。3)5％辅酶Ι：称取辅酶Ι5g溶解于100ml去离子水，0.22μm滤器过滤除菌，分装，-20℃保存备用。(4)高效液体培养基的制备：使用前，向基础培养基中加入过滤除菌的5％精氨酸溶液1～5ml、5％半胱氨酸溶液1～5ml、5％辅酶Ι1～5ml、10万U/ml青霉素5～10ml、56℃灭活的健康猪血清80～200ml，基础培养基定容至1000ml。(5)高效固体培养基的制备：按配比向未高压灭菌的基础培养基中称取琼脂糖8～15g，115℃高压灭菌20min，待培养基冷凉至50～60℃时，按配比量取过滤除菌的5％精氨酸溶液1～5ml、5％半胱氨酸溶液1～5ml、5％辅酶Ι1～5ml、10万U/ml青霉素5～10ml、56℃灭活的健康猪血清80～200ml，总体积为1000ml。铺平板，4℃保存备用。本专利技术涉及生物材料资源信息猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae)兔化本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪肺炎支原体培养基，由基础培养基包括20×Hank′s 25～35ml、酵母提取物1～5g、乳蛋白水解物0.5～3g、牛心提取物5～12g、去离子水770～870ml，辅助培养基包括5％精氨酸溶液1～5ml、5％半胱氨酸溶液1～5ml、5％辅酶Ι1～5ml、10万U/ml青霉素5～10ml和灭活的健康猪血清80～200ml组成。

【技术特征摘要】
1.一种猪肺炎支原体培养基，由基础培养基包括20×Hank′s25～35ml、酵母提取物1～5g、乳蛋白水解物0.5～3g、牛心提取物5～12g、去离子水770～870ml，辅助培养基包括5％精氨酸溶液1～5ml、5％半胱氨酸溶液1～5ml、5％辅酶Ι1～5ml、10万U/ml青霉素5～10ml和灭活的健康猪血清80～200ml组成。2.根据权利要求1所述的一种猪肺炎支原体培养基，其特征在于它能培养猪肺炎支原体兔化弱毒株，并且培养的CCU滴度可以达到109～1010，所需猪血清浓度不超过10％。3.根据权利要求1所述的一种高效猪肺炎支原体培养基，其特征在于20×Hank′s液包括20×Hank′s1和20×Hank′s2，其中：20×Hank′s1：NaCl12～16g、MgSO4.7H2O0.1g～0.5g、KCl0.4～1.0g、MgCl2.6H2O0.1～0.5g、CaCl20.2～0.5g、去离子水100ml；20×Hank...

【专利技术属性】
技术研发人员：车巧林，董彦鹏，缪芬芳，耿晓眉，靳蒙蒙，胡静雅，沈晓红，
申请(专利权)人：江苏南农高科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32