载肝素/多聚赖氨酸纳米粒子透明质酸水凝胶的制备方法技术

一种载肝素/多聚赖氨酸纳米粒子透明质酸水凝胶的制备方法，其步骤如下：A、多巴胺的接枝：将透明质酸溶液经1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺和N‑羟基琥珀酰亚胺活化,再调至酸性；加入多巴胺，反应9‑12小时；B、纳米粒子的制备：将肝素溶液与内皮生长因子溶液等体积混合，制成混合液；再加入到多聚赖氨酸溶液中，得到装载有内皮生长因子的肝素/多聚赖氨酸纳米粒子溶液；C、纳米粒子的加入：将透明质酸溶液加入纳米粒子溶液中得复合溶液；D、水凝胶的形成：将复合溶液调至碱性，加入高碘酸钠即得。该法制得的透明质酸水凝胶，能延缓生长因子释放，更长久的促进内皮细胞生长，又能为内皮细胞提供有益的三维生长空间，具备良好的诱导组织修复功能。

Preparation method of hyaluronic acid hydrogel containing heparin / poly lysine nanoparticles

A method for preparing heparin / poly lysine nanoparticles of hyaluronic acid hydrogels, which comprises the following steps: grafting A and dopamine: hyaluronic acid solution by 1 (3 two dimethylamino propyl) 3 ethyl two carbon imine and N hydroxysuccinimide activated, and then transferred to acid join; dopamine, reaction of 9 12 hours; B, preparation of nanoparticles: heparin solution and endothelial growth factor solution mixing into mixed liquid; adding to polylysine, are loaded with endothelial growth factor heparin / poly lysine nano particle solution; adding C nanoparticles: hyaluronic acid solution is added into the composite nanoparticles solution solution; the formation of D, hydrogel: composite solution to alkalinity, adding sodium periodate to obtain. Hyaluronic acid hydrogels can be obtained by this method, can delay the release of growth factor, promote the growth of endothelial cells for a long time, and can provide a three-dimensional growth space beneficial to endothelial cells induced by tissue have good repair function.

【技术实现步骤摘要】
载肝素/多聚赖氨酸纳米粒子透明质酸水凝胶的制备方法
本专利技术涉及一种透明质酸水凝胶的制备方法。
技术介绍
透明质酸是一种分布在多种组织细胞外基质中的蛋白多糖，具有良好的生物相容性，并在生物发育和机体损伤修复过程中发挥重要作用。透明质酸水凝胶已成为一种有前景的生物材料，并在三维细胞培养、生长因子释放、组织工程支架以及再生医学领域得到广泛应。透明质酸水凝胶用于生长因子释放时，如直接将生长因子加入到透明质酸水凝胶中，随着水凝胶的降解会出现突释现象，从而缩短生长因子的作用时间。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种载肝素/多聚赖氨酸纳米粒子透明质酸水凝胶的制备方法，该方法制得的透明质酸水凝胶用于生长因子释放时，既能延缓生长因子的释放，更长久的促进内皮细胞生长，又能为内皮细胞提供有益的三维生长空间，具备良好的诱导组织修复功能。本专利技术实现其专利技术目的所采用的技术方案是，载肝素/多聚赖氨酸纳米粒子透明质酸水凝胶的制备方法，其步骤如下：A、多巴胺的接枝将透明质酸溶液经1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺活化,再调至酸性；然后加入多巴胺，反应9-12小时；其中透明质酸溶液中的透明质酸的质量与加入的多巴胺的质量之比为5-10:3；B、纳米粒子的制备将浓度为10-30g/L的肝素溶液与浓度为200-400mg/L的内皮生长因子溶液等体积混合，制成肝素与内皮生长因子的混合液；再将混合液缓慢加入到等体积的浓度为0.5-1.5g/L的多聚赖氨酸溶液中，得到装载有内皮生长因子的肝素/多聚赖氨酸纳米粒子溶液；C、纳米粒子的加入将步骤A得到的透明质酸溶液中，加入B步骤得到的肝素/多聚赖氨酸纳米粒子溶液中，得到复合溶液；所述的透明质酸溶液与肝素/多聚赖氨酸纳米粒子溶液的体积比为10:1-5；D、水凝胶的形成将步骤C得到的复合溶液，用氢氧化钠调节至碱性，再加入高碘酸钠即得；所述的高碘酸钠与A步骤的多巴胺上的酚羟基的摩尔比为1:1-2。本专利技术的反应过程与机理主要是：A步的透明质酸在EDC{1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺}和NHS{N-羟基琥珀酰亚胺}活化后，酸性条件下，透明质酸上活化后的羟基与多巴胺上的氨基反应，将多巴胺接枝到透明质酸上。B步的内皮生长因子与肝素上的特异性位点结合形成肝素/内皮生长因子复合物；肝素/内皮生长因子复合物通过静电结合作用吸附大分子量的多聚赖氨酸形成纳米粒子；得到装载内皮生长因子的肝素/多聚赖氨酸纳米粒子。然后，将装载内皮生长因子的的肝素/多聚赖氨酸纳米粒子加入到A步经多巴胺修饰过的透明质酸溶液中，最后加入高碘酸钠将多巴胺上的酚羟基氧化成醌基并交联到透明质酸上，形成有益内皮细胞生长三维空间的透明质酸水凝胶。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：一、肝素与内皮生长因子的结合可以延缓生长因子释放、延长其半衰期，同时能在体内环境下保护内皮生长因子，避免被蛋白酶降解，促进内皮生长因子与其相应受体间的识别与结合，保证内皮生长因子功能的发挥。二、透明质酸水凝胶具有良好的生物相容性，又能为内皮细胞提供良好的三维生长微环境；使得本专利技术的载内皮生长因子的肝素/多聚赖氨酸纳米粒子加入到透明质酸水凝胶既具有良好的生物相容性，又能为内皮细胞生长提供较好的三维微环境，从而促进内皮细胞的迁移，具有更好的诱导组织修复的功能。进一步，本专利技术A步骤中的将透明质酸溶液经1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺活化,再调至酸性的具体作法是：将透明质酸溶液同时加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，搅拌15-30分钟；其中透明质酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:1:1；再加入盐酸使溶液呈酸性。下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步的详细说明。附图说明图1为实施例一A步骤得到的经多巴胺修饰的透明质酸的紫外光谱图。图2为仅加入了内皮生长因子的透明质酸水凝胶(HA-DAP-V)和实施例一得到的载肝素/多聚赖氨酸纳米粒子透明质酸水凝胶(HA-DAP-NPV)表面的生长因子累计释放量统计曲线。图3a为内皮细胞在仅加入了内皮生长因子的透明质酸水凝胶(HA-DAP-V)表面的24小时迁移图。图3b为内皮细胞在实施例一得到的载肝素/多聚赖氨酸纳米粒子透明质酸水凝胶(HA-DAP-NPV)表面的24小时迁移图。具体实施方式实施例一一种载肝素/多聚赖氨酸纳米粒子透明质酸水凝胶的制备方法，其步骤如下：A、多巴胺的接枝将透明质酸溶液经1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺活化,再调至酸性；然后加入多巴胺，反应9小时；其中透明质酸溶液中的透明质酸的质量与加入的多巴胺的质量之比为5:3；其中，将透明质酸溶液经1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺活化,再调至酸性的具体作法是：将透明质酸溶液同时加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，搅拌15分钟；其中透明质酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:1:1；再加入盐酸使溶液呈酸性。B、纳米粒子的制备将浓度为10g/L的肝素溶液与浓度为200μg/L的内皮生长因子溶液等体积混合，制成肝素与内皮生长因子的混合液；再将混合液缓慢加入到等体积的浓度为0.5g/L的多聚赖氨酸溶液中，得到装载有内皮生长因子的肝素/多聚赖氨酸纳米粒子溶液；C、纳米粒子的加入将步骤A得到的透明质酸溶液，加入B步骤得到的肝素/多聚赖氨酸纳米粒子溶液中，得到复合溶液；所述的透明质酸溶液与肝素/多聚赖氨酸纳米粒子溶液的体积比为10:1；D、水凝胶的形成将步骤C得到的复合溶液，用氢氧化钠调节至碱性，再加入高碘酸钠即得；所述的高碘酸钠与A步骤的多巴胺上的酚羟基的摩尔比为1:1。图1为实施例一A步骤得到的经多巴胺修饰的透明质酸的紫外光谱图。其中280nm处有酚羟基的特征吸收峰，说明多巴胺接枝到了透明质酸上。图2为仅加入了内皮生长因子的透明质酸水凝胶(HA-DAP-V)和实施例一得到的载肝素/多聚赖氨酸纳米粒子透明质酸水凝胶(HA-DAP-NPV)表面的生长因子累计释放量统计曲线。图2表明载肝素/多聚赖氨酸纳米粒子透明质酸水凝胶中的内皮生长因子在21天内各时间段的释放量均低于普通的透明质酸水凝胶(HA-DAP-V)中的内皮生长因子的释放量，说明载肝素/多聚赖氨酸纳米粒子透明质酸水凝胶能够延缓生长因子释放、延长其半衰期的功效。图3a为内皮细胞在单纯的透明质酸水凝胶(HA-DAP)表面的24小时迁移图。图3b为内皮细胞在实施例一得到的载肝素/多聚赖氨酸纳米粒子透明质酸水凝胶(HA-DAP-NPV)表面的24小时迁移图。图3a和图3b表明内皮细胞在实施例一得到的载肝素/多聚赖氨酸纳米粒子透明质酸水凝胶(HA-DAP-NPV)表面的24小时内的迁移明显快于内皮细胞在单纯的透明质酸水凝胶中的迁移。也即载肝素/多聚赖氨酸纳米粒子透明质酸水凝胶具有更强的促进内皮细胞的迁移能力和更好的诱导组织修复的功能。实施例二一种载肝素/多聚赖氨酸纳米粒子透明质酸水凝胶的制备方法，其步骤如下：A、多巴胺的接枝将透明质酸溶液经1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基本文档来自技高网...

【技术保护点】
载肝素/多聚赖氨酸纳米粒子透明质酸水凝胶的制备方法，其步骤如下：A、多巴胺的接枝将透明质酸溶液经1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺和N‑羟基琥珀酰亚胺活化,再调至酸性；然后加入多巴胺，反应9‑12小时；其中透明质酸溶液中的透明质酸的质量与加入的多巴胺的质量之比为5‑10:3；B、纳米粒子的制备将浓度为10‑30g/L的肝素溶液与浓度为200‑400mg/L的内皮生长因子溶液等体积混合，制成肝素与内皮生长因子的混合液；再将混合液缓慢加入到等体积的浓度为0.5‑1.5g/L的多聚赖氨酸溶液中，得到装载有内皮生长因子的肝素/多聚赖氨酸纳米粒子溶液；C、纳米粒子的加入将步骤A得到的透明质酸溶液，加入B步骤得到的肝素/多聚赖氨酸纳米粒子溶液中，得到复合溶液；所述的透明质酸溶液与肝素/多聚赖氨酸纳米粒子溶液的体积比为10:1‑5；D、水凝胶的形成将步骤C得到的复合溶液，用氢氧化钠调节至碱性，再加入高碘酸钠即得；所述的高碘酸钠与A步骤的多巴胺上的酚羟基的摩尔比为1:1‑2。

【技术特征摘要】
1.载肝素/多聚赖氨酸纳米粒子透明质酸水凝胶的制备方法，其步骤如下：A、多巴胺的接枝将透明质酸溶液经1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺活化,再调至酸性；然后加入多巴胺，反应9-12小时；其中透明质酸溶液中的透明质酸的质量与加入的多巴胺的质量之比为5-10:3；B、纳米粒子的制备将浓度为10-30g/L的肝素溶液与浓度为200-400mg/L的内皮生长因子溶液等体积混合，制成肝素与内皮生长因子的混合液；再将混合液缓慢加入到等体积的浓度为0.5-1.5g/L的多聚赖氨酸溶液中，得到装载有内皮生长因子的肝素/多聚赖氨酸纳米粒子溶液；C、纳米粒子的加入将步骤A得到的透明质酸溶液，加入B步骤得到的肝素/多聚赖氨酸纳米粒子溶液中，得到复合溶...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈俊英，许方亭，催园园，魏来，谭建英，曾峥，黄思悦，高霞丽，
申请(专利权)人：西南交通大学，
类型：发明
国别省市：四川,51