一种人类诱导性多能干细胞专用冻存试剂及冻存方法技术

本发明专利技术公开了一种人类诱导性多能干细胞专用冻存试剂及冻存方法，其中，该冻存试剂的组成成分及其含量分别为：重组人白蛋白0.03mg/100ml、重组人表皮生长蛋白0.0125mg/100ml、b‑巯基乙醇1ml/100ml、DMEM‑F12培养基91ml/100ml、二甲基亚砜8ml/100ml、海藻糖5g/100ml。本发明专利技术的有益之处在于：(1)成分完全明确，便于质量控制；(2)使用重组人白蛋白取代动物成分的胎牛血清，避免含动物血清成分，安全可靠，适于临床应用；(3)配方中的重组人表皮生长蛋白、b‑巯基乙醇、海藻糖可以很好的保护细胞在低温环境下处于休眠状态，细胞内部结构不产生冰晶，从而保持细胞的活性，有效防止出现细胞分化，并且冻存细胞的复苏率可达到96％以上；(4)冻存试剂属即用型，使用十分方便。

【技术实现步骤摘要】
一种人类诱导性多能干细胞专用冻存试剂及冻存方法
本专利技术涉及一种冻存试剂及细胞冻存方法，具体涉及一种人类诱导性多能干细胞专用的冻存试剂，以及利用该冻存试剂冻存人类诱导性多能干细胞的方法，属于细胞生物学

技术介绍
人类诱导性多能干细胞是当前干细胞研究的热点和焦点。它可以分化成体内所有的细胞，进而形成身体的所有组织和器官。因此，多能干细胞的研究不仅具有重要的理论意义，而且在器官再生、修复和疾病治疗方面极具应用价值。在多能干细胞的研究过程中，经常会涉及到细胞冻存。细胞冻存的过程会显著改变细胞的热力学、化学和物理环境，同时伴随生物性损伤的危险。影响冻存效率的因素主要有：细胞浓度、冷冻速率以及冻存试剂。其中，冻存试剂是细胞冻存过程中的核心试剂，关系到细胞储存质量和复苏后细胞数量及活性。目前，冻存人类诱导性多能干细胞一般采用90％血清加10％DMSO作为冻存液，这种冻存液需要现用现配，操作繁琐，容易造成污染，而且批次不稳定，会造成后续细胞复苏时细胞状态不稳定。为获得来源方便的人类诱导性多能干细胞，开展有效的人类诱导性多能干细胞移植及建立人类诱导性多能干细胞库，改进人类诱导性多能干细胞冻存复苏技术，研究开发一种能够长期低温保存人类诱导性多能干细胞的冻存试剂以及相应的干细胞冻存方法对促进人类诱导性多能干细胞的研究和应用具有重大意义。
技术实现思路
为解决现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种成分完全明确、安全可靠、在-196℃液氮环境下能够长期安全保存人类诱导性多能干细胞的冻存试剂，以及利用该冻存试剂冻存人类诱导性多能干细胞的方法。为了实现上述目标，本专利技术采用如下的技术方案：一种人类诱导性多能干细胞专用的冻存试剂，其特征在于，该冻存试剂的组成成分及其含量分别为：一种人类诱导性多能干细胞的冻存方法，其特征在于，包括以下步骤：Step1：将前述的冻存试剂恢复至室温；Step2：将经消化后的人类诱导性多能干细胞加入Step1所述的冻存试剂中，重悬细胞，得到细胞悬液；Step3：将Step2所述的细胞悬液先在4℃环境下放置1h，再在-20℃环境下放置2h，最后移入液氮中长期保存。前述的冻存方法，其特征在于，在Step2中，前述细胞悬液中细胞浓度为5×106个细胞/ml-8×106个细胞/ml。本专利技术的有益之处在于：(1)冻存试剂成分完全明确，便于质量控制；(2)使用重组人白蛋白取代动物成分的胎牛血清，冻存试剂避免含动物血清成分，安全可靠，适于临床应用；(3)配方中的重组人表皮生长蛋白、b-巯基乙醇、海藻糖可以很好的保护细胞在低温环境下处于休眠状态，细胞内部结构不产生冰晶，从而保持细胞的活性，有效防止出现细胞分化，并且冻存细胞的复苏率可达到96％以上；(4)冻存试剂属于即用型，使用起来十分方便；(5)冻存方法简单易操作。附图说明图1是每代复苏后的细胞的复苏率统计图；图2是复苏后的P3代人类诱导性多能干细胞的生长状态图；图3是冻存不同时间后的细胞的复苏率统计图；图4(a)是SSEA4免疫荧光染色图；图4(b)是SSEA4免疫荧光染色后细胞核染色图；图5(a)是TRA-1-81免疫荧光染色图；图5(b)是TRA-1-81免疫荧光染色后细胞核染色图；图6(a)是TRA-1-60免疫荧光染色图；图6(b)是TRA-1-60免疫荧光染色后细胞核染色图；图7(a)是NANOG免疫荧光染色图；图7(b)是NANOG免疫荧光染色后细胞核染色图。具体实施方式以下结合附图和具体实施例对本专利技术作具体的介绍。一、配制冻存试剂每100ml冻存试剂中含有以下组分：整个配方成分完全明确，便于质量控制，并且避免含动物血清成分，安全可靠，适于临床应用。配制方法：取DMEM-F12培养基，依次加入海藻糖、重组人白蛋白、重组人表皮生长蛋白、b-巯基乙醇和二甲基亚砜，混合均匀即得。在本专利技术的配方中：重组人白蛋白取代了动物成分的胎牛血清，避免了动物成分的存在，更加安全，同时也能让细胞获得足够的养分；重组人表皮生长蛋白、b-巯基乙醇和海藻糖可以很好的保护细胞在低温环境下处于休眠状态，细胞内部结构不产生冰晶，从而保持细胞的活性，有效防止出现细胞分化。本配方通过研究人类诱导性多能干细胞的培养条件，优选出几种重要成分，通过组合使用这些成分配制出的冻存试剂，更加适合人类诱导性多能干细胞不受低温环境的影响，复苏后细胞活性依然很高，而其他细胞的培养条件与人类诱导性多能干细胞有很大的差异，所以该冻存试剂仅限于人类诱导性多能干细胞。二、冻存细胞将经消化后的人类诱导性多能干细胞计数后，用本专利技术的冻存试剂进行细胞重悬，细胞密度为5×106个细胞/ml-8×106个细胞/ml，重悬后用1.8ml的冻存管盛装细胞悬液，盛装量为1ml/管，然后各实验室按照自己的降温方法将细胞悬液降温冷冻，最后再移入液氮中进行长期保存即可。本专利技术的细胞冻存试剂属于即用型试剂，使用起来十分方便。三、检验冻存结果1、细胞复苏率试验(1)细胞传代4代的细胞复苏率(每代冻存时间4周)从P2代开始连续冻存复苏至P4代，每代复苏后的细胞的复苏率如图1所示。其中，复苏后的P3代人类诱导性多能干细胞的生长状态如图2所示。(2)冻存不同时间后的细胞复苏率选取P3代细胞进行冻存，依次在冻存后的第2周、第1个月、第6个月、第12个月后进行细胞复苏，观察并记录细胞复苏率，记录的结果如图3所示。结论：本专利技术的冻存试剂可以维持人类诱导性多能干细胞在-196℃液氮环境下长期安全保存。2、复苏后的细胞抗原表达情况免疫荧光染色复苏后的细胞抗原的表达：stage-specificembryonicantigen-4(SSEA4)、tumourrejectionantigen(TRA)-1-81、TRA-1-60和nucleartranscriptionfactorsNanoghomeobox(NANOG)。细胞核用4’，6-diamidino-2-phenylindole(蓝色)染色，比例尺为100um。染色结果如图4(a)、图4(b)、图5(a)、图5(b)、图6(a)、图6(b)、图7(a)和图7(b)所示。结论：复苏后的细胞仍然高度表达SSEA4、TRA-1-81、TRA-1-60、NANOG等抗原，这说明复苏后的人类诱导性多能干细胞未出现分化，依然保持很好的未分化状态。综上所述，本专利技术的冻存试剂可以维持人类诱导性多能干细胞在-196℃液氮环境下长期安全保存，有效防止出现细胞分化，并且冻存细胞的复苏率可达到96％以上，这对促进人类诱导性多能干细胞的研究和应用具有重大意义。需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本专利技术，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本专利技术的保护范围内。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人类诱导性多能干细胞专用的冻存试剂，其特征在于，该冻存试剂的组成成分及其含量分别为：

【技术特征摘要】
1.一种人类诱导性多能干细胞专用的冻存试剂，其特征在于，该冻存试剂的组成成分及其含量分别为：2.一种人类诱导性多能干细胞的冻存方法，其特征在于，包括以下步骤：Step1：将权利要求1所述的冻存试剂恢复至室温；Step2：将经消化后的人类诱导性多能干细胞加入Step1所述的冻存试...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚玲玲，杨敏，孟得龙，杨苗，
申请(专利权)人：北京焕生汇生物技术研究院，
类型：发明
国别省市：北京,11