一种微斑报春苣苔的无菌播种和组织培养方法技术

本发明专利技术属于生物工程技术领域，具体涉及一种微斑报春苣苔的组织培养方法。一种微斑报春苣苔的无菌萌发和组织培养方法，包括如下步骤：无菌萌发、初代培养、不定芽增殖培养、愈伤组织分化、生根培养和炼苗移栽。本发明专利技术的微斑报春苣苔的组织培养方法具有种子萌发率高、成苗快、种苗品质好等特点，能在短期内获得大量的组培苗，是微斑报春苣苔种苗生产及资源保护的有效途径。

【技术实现步骤摘要】
一种微斑报春苣苔的无菌播种和组织培养方法
本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种微斑报春苣苔的无菌播种和组织培养方法。
技术介绍
微斑报春苣苔(Primulinaminutimaculata)为苦苣苔科报春苣苔属的多年生草本植物。分布于广西龙州、天等，生于石山林下石上，海拔200-450m，花期4-5月。微斑报春苣苔在龙州和天等的分布范围虽然较广，但分布零星，且居群小，植株个体数量较少，自身更新困难。此外，由于开山筑路等对生境严重破坏，导致居群迅速退缩，目前已处于濒危状态，IUCN等级为极危。微斑报春苣苔花型独特，叶片具有魅力的斑纹，观赏价值极高，受到国外众多观赏植物爱好者和育种者的广泛关注，是极具开发利用的喀斯特野生花卉。传统的繁殖以种子播种和叶片扦插为主，但繁殖速度慢，繁殖系数小。而组织培养能够在短时间内获得大量遗传性状一致的优质苗，克服了常规繁殖周期长、繁殖系数小的缺点。目前，组织培养在报春苣苔属的其他植物上得到了广泛应用，且多以叶片为外植体，而在微斑报春苣苔上的应用尚未有报道。因此，通过微斑报春苣苔的种子无菌萌发进而进行分化培养、增殖培养、生根培养、炼苗移栽，从而建立微斑报春苣苔的组织培养体系，对其规模化生产和种质资源收集及保存具有积极意义。
技术实现思路
针对现有的微斑报春苣苔人工繁育技术的匮乏与不足，本专利技术提供一种微斑报春苣苔的无菌播种和组织培养方法，该方法具有种子萌发率高、成苗快、种苗品质好等特点，能在短期内获得大量的组培苗，是微斑报春苣苔种苗生产及资源保护的有效途径。为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：一种微斑报春苣苔的无菌播种和组织培养方法，包括如下步骤：(1)种子的无菌萌发：取成熟未开裂的微斑报春苣苔的果荚，用洗洁精浸洗10-15min后在流水下冲洗干净10-15min，在超净工作台上先用75％酒精中浸泡果荚30-40s，无菌水冲洗3-5次，再用0.1％升汞溶液浸泡果荚12-15min，无菌水冲洗3-5次，在接种盘上切开果荚，并用经过消毒灭菌的勺子轻轻将种子拨入种子萌发培养基中，播种好的种子先在光照培养箱中暗培养至种子萌发，然后再转入培养室中光培养；所述的0.1％升汞溶液中加入有吐温-20，每100mL0.1％升汞溶液中加入2滴吐温-20；(2)初代培养：将已经萌发子叶但尚未长出真叶的小苗切成子叶、胚轴两部分，然后接入不同的初代培养基中；子叶28-32d可直接诱导出不定芽，并且在子叶基部有愈伤组织产生；胚轴30d能诱导愈伤组织；(3)不定芽的增殖培养：将具有1对以上叶片的不定芽切取下来，接入增殖培养基中培养26-28d；(4)愈伤组织的分化培养：将愈伤组织切成1cm×1cm的小块接入分化培养基中培养29-30d；(5)生根培养：当组培芽具有2对以上叶片时，转接于生根培养基中培养23-25d；(6)炼苗移栽：将具有2-3对叶片的生根苗移出培养室，在温室中炼苗10-14d；洗净培养基移栽到装有基质的50孔穴盘中，浇透定根水后，将移栽小苗置于有遮阳网的荫棚下，透光率为40-50％，移栽7d后，用1/2MS营养液浇淋，连续淋2次，时间间隔为7d，移栽后20d后统计成活率。作为优选，步骤(1)中所述的暗培养的温度为17-20℃；所述的光培养温度23-25℃，光照为1000-1400lx。作为优选，步骤(1)中所述的萌发培养基以MS+GA31.0-2.0mg/L+活性炭0.5g/L。作为优选，步骤(2)中用于子叶的不定芽诱导培养基为MS+KT1.0-2.0mg/L+NAA0.01-0.1mg/L，愈伤组织诱导培养基为MS+CPPU0.1-1.0mg/L+2,4-D1.5-2.0mg/L；用于胚轴的愈伤组织诱导培养基为MS+CPPU0.1-1.0mg/L+2,4-D1.5-2.0mg/L。作为优选，步骤(3)中所述的增殖培养基以MS+6-BA1.0-3.0mg/L+IBA0.1-0.30mg/L+土豆30g/L+香蕉30g/L+苹果20g/L+椰汁100ml/L。作为优选，步骤(4)中所述的分化培养基为MS+ZT0.1-1.0mg/L+IBA0.1-0.3mg/L+土豆30g/L+香蕉30g/L+苹果20g/L+椰汁100ml/L。作为优选，步骤(5)中所述的生根培养基为1/2MS+IBA1.0-3.0mg/L+椰汁50ml/L+活性炭1.0g/L。作为优选，所述1/2MS培养基为：将MS培养基中的大量元素减至一半，蔗糖为15g/L，其余成分及用量与MS保持一致。作为优选，步骤(6)中所述的基质由泥炭和粗沙按照体积比为2:1组成。作为优选，步骤(6)中所述的1/2MS营养液为MS培养基中的大量元素减半，其余成分及用量与MS保持一致，不添加蔗糖和琼脂。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术的微斑报春苣苔的组织培养方法具有种子萌发率高、成苗快、种苗品质好等特点，能在短期内获得大量的组培苗，是微斑报春苣苔种苗生产及资源保护的有效途径。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。在不背离本专利技术精神和本质的情况下，对本专利技术方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本专利技术的范围。实施例1：一种微斑报春苣苔的无菌播种和组织培养方法，包括如下步骤：(1)种子的无菌萌发：取成熟未开裂的微斑报春苣苔的果荚，用洗洁精浸洗10min后在流水下冲洗干净10min，在超净工作台上先用75％酒精中浸泡果荚30s，无菌水冲洗3次，再用0.1％升汞溶液浸泡果荚12min，无菌水冲洗3次，在接种盘上切开果荚，并用经过消毒灭菌的勺子轻轻将种子拨入种子萌发培养基中，播种好的种子先在光照培养箱中暗培养至种子萌发，然后再转入培养室中光培养；所述的暗培养的温度为17℃；所述的光培养温度23℃，光照为1000lx；所述的萌发培养基以MS+GA31.0mg/L+活性炭0.5g/L；所述的0.1％升汞溶液中加入有吐温-20，每100mL0.1％升汞溶液中加入2滴吐温-20；(2)初代培养：将已经萌发子叶尚未长出真叶的小苗切成子叶、胚轴两部分，然后接入不同的初代培养基中；子叶28d可直接诱导出不定芽，并且在子叶基部有愈伤组织产生；胚轴30d能诱导愈伤组织；用于子叶的不定芽诱导培养基为MS+KT1.0mg/L+NAA0.01mg/L，愈伤组织诱导培养基为MS+CPPU0.1mg/L+2,4-D1.5mg/L；用于胚轴的愈伤组织诱导培养基为MS+CPPU0.1mg/L+2,4-D1.5mg/L；(3)不定芽的增殖培养：将具有1对以上叶片的不定芽切取下来，接入增殖培养基中培养26d；所述的增殖培养基以MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.1mg/L+土豆30g/L+香蕉30g/L+苹果20g/L+椰汁100ml/L；(4)愈伤组织的分化培养：将愈伤组织切成1cm×1cm的小块接入分化培养基中培养29d；所述的分化培养基为MS+ZT0.1mg/L+IBA0.1mg/L+土豆30g/L+香蕉30g/L+苹果20g/L+椰汁100ml/L；(5)生根培养：当组培芽具有2对以上叶片时，转接于生根培养基中培养23d；所述的最佳生根培养基为1/2MS+IBA1.0mg/L+椰汁50ml/L+活性炭1.0g/L；所述1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种微斑报春苣苔的无菌播种和组织培养方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)种子的无菌萌发：取成熟未开裂的微斑报春苣苔的果荚，用洗洁精浸洗10‑15min后在流水下冲洗干净10‑15min，在超净工作台上先用75％酒精中浸泡果荚30‑40s，无菌水冲洗3‑5次，再用0.1％升汞溶液浸泡果荚12‑15min，无菌水冲洗3‑5次，在接种盘上切开果荚，并用经过消毒灭菌的勺子轻轻将种子拨入种子萌发培养基中，播种好的种子先在光照培养箱中暗培养至种子萌发，然后再转入培养室中光培养；所述的0.1％升汞溶液中加入有吐温‑20，每100mL0.1％升汞溶液中加入2滴吐温‑20；(2)初代培养：将已经萌发子叶但尚未长出真叶的小苗切成子叶、胚轴两部分，然后接入不同的初代培养基中；子叶28‑32d可直接诱导出不定芽，并且在子叶基部有愈伤组织产生；胚轴30d能诱导愈伤组织；(3)不定芽的增殖培养：将具有1对以上叶片的不定芽切取下来，接入增殖培养基中培养26‑28d；(4)愈伤组织的分化培养：将愈伤组织切成1cm×1cm的小块接入分化培养基中培养29‑30d；(5)生根培养：当组培芽具有2对以上叶片时，转接于生根培养基中培养23‑25d；(6)炼苗移栽：将具有2‑3对叶片的生根苗移出培养室，在温室中炼苗10‑14d；洗净培养基移栽到装有基质的50孔穴盘中，浇透定根水后，将移栽小苗置于有遮阳网的荫棚下，透光率为40‑50％，移栽7d后，用1/2MS营养液浇淋，连续淋2次，时间间隔为7d，移栽后20d后统计成活率。...

【技术特征摘要】
1.一种微斑报春苣苔的无菌播种和组织培养方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)种子的无菌萌发：取成熟未开裂的微斑报春苣苔的果荚，用洗洁精浸洗10-15min后在流水下冲洗干净10-15min，在超净工作台上先用75％酒精中浸泡果荚30-40s，无菌水冲洗3-5次，再用0.1％升汞溶液浸泡果荚12-15min，无菌水冲洗3-5次，在接种盘上切开果荚，并用经过消毒灭菌的勺子轻轻将种子拨入种子萌发培养基中，播种好的种子先在光照培养箱中暗培养至种子萌发，然后再转入培养室中光培养；所述的0.1％升汞溶液中加入有吐温-20，每100mL0.1％升汞溶液中加入2滴吐温-20；(2)初代培养：将已经萌发子叶但尚未长出真叶的小苗切成子叶、胚轴两部分，然后接入不同的初代培养基中；子叶28-32d可直接诱导出不定芽，并且在子叶基部有愈伤组织产生；胚轴30d能诱导愈伤组织；(3)不定芽的增殖培养：将具有1对以上叶片的不定芽切取下来，接入增殖培养基中培养26-28d；(4)愈伤组织的分化培养：将愈伤组织切成1cm×1cm的小块接入分化培养基中培养29-30d；(5)生根培养：当组培芽具有2对以上叶片时，转接于生根培养基中培养23-25d；(6)炼苗移栽：将具有2-3对叶片的生根苗移出培养室，在温室中炼苗10-14d；洗净培养基移栽到装有基质的50孔穴盘中，浇透定根水后，将移栽小苗置于有遮阳网的荫棚下，透光率为40-50％，移栽7d后，用1/2MS营养液浇淋，连续淋2次，时间间隔为7d，移栽后20d后统计成活率。2.根据权利要求1所述的微斑报春苣苔的无菌播种和组织培养方法，其特征在于，步骤(1)中所述的暗培养的温度为17-20℃；所述的光培养温度23-25℃，光照为1000-1400lx。3.根据权利要求1所述的微斑报春苣苔的无菌播种和组织培养方法，其特征在于，步骤(1)中所述的萌发培养基以...

【专利技术属性】
技术研发人员：闫海霞，邓杰玲，卜朝阳，黄昌艳，何荆洲，关世凯，陶大燕，
申请(专利权)人：广西壮族自治区农业科学院花卉研究所，
类型：发明
国别省市：广西,45