一种产气荚膜梭菌α毒素抗体捕获ELISA检测方法技术

本发明专利技术涉及动物细菌学领域，提供了产气荚膜梭菌α毒素抗体的捕获ELISA检测方法，该方法以制备的A型产气荚膜梭菌外毒素为抗原，一是用来免疫兔制备高免血清，二是浓缩、纯化后作为捕获ELISA的结合抗原；检测方法包括以下步骤：(1)包被(2)封闭(3)加抗原(4)加待检样品(5)加入二抗(6)显色(7)终止(8)结果判定。此方法具有特异性高、灵敏度强、可重复性好、成本低等优点，另外此方法可以大批量检测样品，为该病的检测和研究提供了有效，简便的血清学诊断方法。

【技术实现步骤摘要】
一种产气荚膜梭菌α毒素抗体捕获ELISA检测方法
本专利技术涉及动物细菌学领域，本专利技术提供了一种产气荚膜梭菌α毒素抗体捕获ELISA检测方法。
技术介绍
产气荚膜梭菌(C.perfringens)又称魏氏梭菌(C.welchii)，广泛存在于自然环境中，并见于几乎所有温血动物的消化道内，属于人和动物肠道内正常菌群的成员。产气荚膜梭菌能引起羔羊痢疾和羔羊、牛犊、仔猪、家兔、雏鸡的坏死性肠炎、肠毒血症等疾病，发病急、死亡率高，是严重危害养殖业的重要疾病，是近年来我国家畜“猝死症”的主要病原，给各国畜牧业发展带来巨大经济损失。各型产气荚膜梭菌均产生α毒素(CPA)，本菌能引起人类气性坏疽及多种动物的肠毒血症和坏死性肠炎，当家畜被感染后其体内产生α毒素抗体，因此α毒素抗体是诊断产气荚膜梭菌病的重要依据之一。现有技术中小白鼠毒素中和试验是检测产气荚膜梭菌毒素抗体的经典方法,虽然准确可靠,但费时、费工。而卵磷脂水解抑制试验欠敏感,且重复性差,操作繁琐,难于推广应用。近年来随着生物技术的发展，国外已经出现多种检测产气荚膜梭菌毒素抗体的商品检测试剂盒，但价格昂贵，因此为了弥补国内产气荚膜梭菌α毒素抗体检测的空白，急切需要建立快速、灵敏、特异并能大批量检测的ELISA方法，为产气荚膜梭菌病诊断、研究提供有效工具。本专利技术的专利技术人曾经申请过的专利：“一种A型产气荚膜梭菌毒素抗体的间接ELISA检测方法”虽然公开了A型产气荚膜梭菌外毒素抗体的间接ELISA检测方法，但是由于其检测的是A型产气荚膜梭菌的所有外毒素，特异性差，无法定性的检测产气荚膜梭菌α毒素，因此难以填补现有技术的空白。
技术实现思路
证实针对现有技术的上述情况，本专利技术的专利技术人提供了提供了一种产气荚膜梭菌α毒素抗体的捕获ELISA检测方法，该方法以制备的A型产气荚膜梭菌外毒素为抗原，一是用来免疫兔制备高免血清，二是浓缩、纯化后作为捕获ELISA的结合抗原；检测方法包括以下步骤：(1)包被(2)封闭(3)加抗原(4)加待检样品(5)加入二抗(6)显色(7)终止(8)结果判定。此方法具有特异性高、灵敏度强、可重复性好、成本低等优点，另外此方法可以大批量检测样品，为该病的检测和研究提供了有效，简便的血清学诊断方法。与先前申请的A型产气荚膜梭菌毒素抗体的间接ELISA检测方法不同，本专利技术的方法可以特异性地检测产气荚膜梭菌α毒素，准确率和特异性均比先前技术有明显的提高，最终所建立的捕获ELISA检测产气荚膜梭菌α毒素抗体方法可用于大批量样品检测，为畜禽产气荚膜梭菌病的诊断及研究提供了更快速、有效的工具，并为疫苗质量和食品安全监测的研究奠定了坚实的基础。专利技术人在本专利技术中所采用的A型产气荚膜梭菌采用现有菌种，特别选自菌种NCTC528(保藏于NationalCollectionofTypeCultures英国国家典型培养物保藏中心，保藏号:NCTC528)，可通过现有渠道直接获得，故而该生物材料属于现有技术中可直接获得的材料，不需进行单独的生物保藏。本专利技术的具体技术方案中主要含有如下几个特殊之处：1A型产气荚膜梭菌毒素抗原的制备:A型产气荚膜梭菌菌种NCTC528接种于血平板培养基上进行复苏，37℃厌氧培养36h，选取单个的菌落接种液体硫乙醇培养基增菌12小时，然后将增菌液按体积百分比5％接种于改良的Gordon汤中，45℃培养5h产毒，将培养物离心后用0.22um蔡氏滤器过滤除菌，得到除菌后的A型产气荚膜梭菌外毒素；取其一部分用甲醛灭活免疫家兔，剩余所获得的外毒素经硫酸铵沉淀，再经透析袋除盐，Sephadex-G25柱层析对外毒素进行除盐纯化浓缩，作为捕获ELISA的捕获抗原；获得上述外毒素之后，专利技术人利用LD50实验测定所产外毒素的活性。如上所述，专利技术人利用其进行了如下的具体应用：(1)甲醛灭活外毒素，得到类毒素，与弗氏佐剂乳化，作为免疫家兔的抗原；(2)硫酸铵沉淀，再经透析袋除盐，Sephadex-G25柱层析对外毒素进行除盐纯化浓缩，作为捕获ELISA的捕获抗原。2.抗产气荚膜梭菌α毒素杂交瘤细胞的复苏及单克隆抗体的制备纯化；将产气荚膜梭菌α毒素的杂交瘤细胞株F12，(保藏于中国微生物菌种保藏中心保藏，保藏编号：CGMCCNo.8870)进行常规复苏、培养；选择6-8周龄雌性BALB/c小鼠10只，腹腔注射弗式不完全佐剂0.5mL/只致敏，一周后注射阳性杂交瘤细胞株F12,剂量0.5-1×106个/只，7-10天后收集小鼠腹水，得到大量产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体，腹水经正辛酸-硫酸铵方法纯化，SDS-PAGE检测纯化效果。3.抗产气荚膜梭菌α毒素多克隆抗体的制备：选取1.0-1.5Kg健康未接种过疫苗的家兔5只，将灭活的上述外毒素2mL和弗氏完全佐剂按照体积1:1混合乳化，背部皮肤多点注射1mg/只；首免两周后，将灭活的外毒素2mL和弗氏不完全佐剂按照体积1:1混合乳化，注射剂量与方法同上；2周后同种方法进行三免；三免后2周用无佐剂抗原加强免疫，剂量与方法同上，所得高免血清作为捕获ELISA阳性对照血清；对照组注射生理盐水，并保证与实验组采取相同的免疫程序，同步进行实验，所得血清作为捕获ELISA阴性对照血清。在获得了上述三个重要技术要素之后，专利技术人进一步提供了捕获ELISA检测方法如下：(1)包被：将上述获得的产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体用抗原包被液稀释到0.3μg/ml,每孔100μL，加入到96孔酶标板，密封4℃过夜；(2)封闭：用PBST洗涤液洗涤上述酶标板3次，每次3min，洗涤完成后，加入含5wt％脱脂奶粉的PBST溶液作为封闭液，每孔200μL，4℃封闭过夜；(3)加抗原：用PBST溶液洗涤上述酶标板3次每次3min并拍干，每孔加入用PBS稀释至2ug/ml的捕获抗原100ul，37℃孵育1h；(4)加待检血清：用PBST溶液洗涤3次每次3min并拍干，每孔加入用PBS缓冲液以1:160体积比稀释的被检血清，100μL/孔，同时设置阴阳性和空白对照，PBS缓冲液作为空白对照，37℃孵育1h；(5)加二抗：用PBST溶液洗涤3次每次3min并拍干，加入用PBS缓冲液按1:8000体积比稀释的HRP标记的羊抗兔IgG,37℃孵育1h；(6)显色：用PBST溶液洗涤3次每次3min并拍干，最后加入可溶性TMB底物显色液100μL/孔,37℃条件避光反应15min；(7)终止：每孔加100ul2MH2SO4溶液终止反应，450nm处读取吸光值。5.结果判定标准的确定计算阴性样品平均值与标准差(SD)，求得为阳性临界值，为阴性临界值。运用建立的捕获ELISA方法测定OD450nm，为阳性，为阴性，为可疑样品。在上述间接ELISA检测方法中，所述的血平板培养基成分为：100ml去离子水、3.7g豆粉琼脂、1g葡萄糖和5％体积比脱纤绵羊血；所述改良的Gordon汤产毒培养基成分为：蛋白胨2g，糊精1g，酵母提取物2g，l-精氨酸1.2g,葡萄糖1g，最后PBS定容至100ml，浓盐酸调节pH为7.5，高温灭菌即得；所述的抗原包被液为：0.1M碳酸盐缓冲液，pH9.6(该包被液的效果针对本专利技术的抗原包被效果最佳)；所述的PBS缓冲液成分为：1L去离子水、磷酸二氢本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种产气荚膜梭菌α毒素抗体捕获ELISA检测方法，其特征在于：具体步骤为：(1)包被：将上述获得的产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体用抗原包被液稀释到0.3μg/ml,每孔100μL，加入到96孔酶标板，密封4℃过夜；(2)封闭：用PBST洗涤液洗涤上述酶标板3次，每次3min，洗涤完成后，加入含5wt％脱脂奶粉的PBST溶液作为封闭液，每孔200μL，4℃封闭过夜；(3)加抗原：用PBST溶液洗涤上述酶标板3次每次3min并拍干，每孔加入用PBS稀释至2ug/ml的捕获抗原100ul，37℃孵育1h；(4)加待检血清：用PBST溶液洗涤3次每次3min并拍干，每孔加入用PBS缓冲液以1:160体积比稀释的被检血清，100μL/孔，同时设置阴阳性和空白对照，PBS缓冲液作为空白对照，37℃孵育1h；(5)加二抗：用PBST溶液洗涤3次每次3min并拍干，加入用PBS缓冲液按1:8000体积比稀释的HRP标记的羊抗兔IgG,37℃孵育1h；(6)显色：用PBST溶液洗涤3次每次3min并拍干，最后加入可溶性TMB底物显色液100μL/孔,37℃条件避光反应15min；(7)终止：每孔加100ul2M H...

【技术特征摘要】
1.一种产气荚膜梭菌α毒素抗体捕获ELISA检测方法，其特征在于：具体步骤为：(1)包被：将上述获得的产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体用抗原包被液稀释到0.3μg/ml,每孔100μL，加入到96孔酶标板，密封4℃过夜；(2)封闭：用PBST洗涤液洗涤上述酶标板3次，每次3min，洗涤完成后，加入含5wt％脱脂奶粉的PBST溶液作为封闭液，每孔200μL，4℃封闭过夜；(3)加抗原：用PBST溶液洗涤上述酶标板3次每次3min并拍干，每孔加入用PBS稀释至2ug/ml的捕获抗原100ul，37℃孵育1h；(4)加待检血清：用PBST溶液洗涤3次每次3min并拍干，每孔加入用PBS缓冲液以1:160体积比稀释的被检血清，100μL/孔，同时设置阴阳性和空白对照，PBS缓冲液作为空白对照，37℃孵育1h；(5)加二抗：用PBST溶液洗涤3次每次3min并拍干，加入用PBS缓冲液按1:8000体积比稀释的HRP标记的羊抗兔IgG,37℃孵育1h；(6)显色：用PBST溶液洗涤3次每次3min并拍干，最后加入可溶性TMB底物显色液100μL/孔,37℃条件避光反应15min；(7)终止：每孔加100ul2MH2SO4溶液终止反应，450nm处读取吸光值；计算阴性样品平均值与标准差(SD)，求得为阳性临界值，为阴性临界值。运用建立的捕获ELISA方法测定OD450nm，为阳性，为阴性，为可疑样品；其中所述产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体获得方法如下：将产气荚膜梭菌α毒素的杂交瘤细胞株F12，保藏于中国微生物菌种保藏中心保藏，保藏编号：CGMCCNo.88...

【专利技术属性】
技术研发人员：王海荣，楚国茹，柴同杰，钟召兵，李超，陈勇，林晓佳，王方山，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：山东,37