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一种基于大肠杆菌表达系统的重组pBpp蛋白制备方法技术方案

技术编号:15717444 阅读:127 留言:0更新日期:2017-06-28 16:04
本发明专利技术提供了一种基于大肠杆菌表达系统的重组pBpp蛋白制备方法,该技术方案以斑马鱼粪便菌群DNA为模板,扩增得到pBpp表达基因,再利用pET28c质粒为载体,先于大肠杆菌TOP10中扩增质粒,而后转化入大肠杆菌BL21中进行蛋白表达。在此基础上,本发明专利技术针对重组菌株的特性设计了适宜的蛋白表达及诱导条件,对于胞内表达的pBpp蛋白,本发明专利技术对菌体进行超声破碎后,先利用镍珠结合游离的蛋白,再进行蛋白洗脱,最后分别利用PBS和甘油进行透析,从而实现了pBpp蛋白的有效纯化。实验发现,本发明专利技术所制备的pBpp蛋白可确切诱导胰腺中β细胞的增殖,从而对因胰岛β细胞损伤所导致的糖尿病起到治疗效果。

Preparation method of recombinant pBpp protein based on Escherichia coli expression system

The present invention provides an expression system based on Escherichia coli pBpp recombinant protein preparation method, the technical scheme of zebrafish fecal flora DNA as template, amplified pBpp gene expression by pET28c plasmid vectors, plasmid amplification prior to Escherichia coli TOP10, and then transformed into the expression of BL21 in Escherichia coli. On this basis, the invention is designed according to the characteristics of the recombinant strains expressing suitable protein and inducing conditions for intracellular expression of pBpp protein, the invention of bacteria for sonication, using nickel bead combined with free protein, and protein elution finally respectively using PBS and glycerol dialysis, so as to realize the the effective purification of pBpp protein. The experiment showed that the pBpp protein prepared by the invention can accurately induce the proliferation of beta cells in the pancreas, thereby treating the diabetes caused by the damage of the beta cell of the pancreas.

【技术实现步骤摘要】
一种基于大肠杆菌表达系统的重组pBpp蛋白制备方法
本专利技术涉及基因工程及蛋白纯化
,具体涉及一种基于大肠杆菌表达系统的重组pBpp蛋白制备方法。
技术介绍
糖尿病是由遗传因素、免疫功能紊乱、微生物感染及其毒素、自由基毒素、精神因素等等各种致病因子作用于机体导致胰岛功能减退、胰岛素抵抗等而引发的糖、蛋白质、脂肪、水和电解质等一系列代谢紊乱综合征,临床上以高血糖为主要特点。目前,我国Ⅱ型糖尿病的患病率增长较快,据1979年在我国30万人口中的调查,糖尿病患病率为0.6%,1989年为2.02%,年均增长0.1%左右,1994年我国普查20万人口,患病率已上升为2.5%,目前20~75岁人群中糖尿病患病率约为3%左右。糖耐量低减患者不低于3%。一般而言,在我国富裕地区的糖尿病患病率高于贫困地区,城市高于农村,肥胖高于正常体重,高龄高于低龄。目前我国糖尿病发病率为1/1000左右,50岁以上的平均患病率为7%以上,40岁以下患病率随着年龄的增长而升高,患者高峰年龄在50~70岁。我国患病率以北京、辽宁、宁夏、甘肃、云南、福建较高,据1979~1997年调查结果表明为全国之首,而新疆、贵州、山西较低。发病率较高的北京、辽宁与最低的贵州、新疆之间相差达10倍,城市发病率高于农村1~4倍,广西地区调查证明,产糖地区糖尿病患病率高于非产糖区2倍。尽管多种治疗方法可以控制血糖浓度,但目前仍未实现糖尿病的根治。现有技术中,药物干预仍是糖尿病治疗的主要手段,其中以GLP-1类似物、DPPIV抑制剂等应用较为广泛。pBpp蛋白(promotingβ-Cellproliferationprotein),是指可诱导胰腺中β细胞增殖、进而促进胰岛素分泌的一类功能性蛋白,由于其不直接参与人体糖代谢机制,因此降糖作用较为温和,对人体副作用较小。然而,此类蛋白的规模化生产是目前制约其临床应用的直接技术问题,其中人源蛋白的获取较为困难,而其他生物来源的pBpp蛋白其药效及安全性又难以得到保障。
技术实现思路
本专利技术旨在针对现有技术的技术缺陷,提供一种基于大肠杆菌表达系统的重组pBpp蛋白制备方法,以解决现有技术中pBpp蛋白难以规模化制备的技术问题。本专利技术要解决的另一技术问题是以基因工程手段获得的、由微生物所表达的重组pBpp蛋白,其纯化较为困难。为实现以上技术目的,本专利技术采用以下技术方案:一种基于大肠杆菌表达系统的重组pBpp蛋白制备方法,包括以下步骤:1)以斑马鱼粪便菌群的总DNA为模板,以序列如SEQIDNo.1所示和序列如SEQIDNo.2所示的片段分别为上、下游引物执行PCR扩增,得到序列如SEQIDNo.3所示的DNA片段,即为pBpp蛋白表达基因;2)取步骤1)所获得的pBpp蛋白表达基因,先经NcoI和XhoI双酶切,酶切产物纯化后采用T4连接酶连接到pET28c上,即得到重组质粒pET28c-pBpp;3)取步骤2)所得的重组质粒pET28c-pBpp,转入大肠杆菌E.coliTop10中,得到重组菌株;4)培养步骤3)所得的重组菌株,从中提取重组质粒pET28c-pBpp,将其转化入大肠杆菌E.coliBL21,即得到重组表达菌株pET28c-pBpp-BL21;5)利用含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基培养步骤4)所得的重组表达菌株pET28c-pBpp-BL21,收集菌体;6)利用EQBuffer重悬步骤5)所得菌体,超声破碎,而后以10000rpm的转速离心10min,取上清;取镍珠,悬浮于EQBuffer中,以4000rpm的转速离心15min,收集沉淀,悬浮于EQBuffer中,再以4000rpm的转速离心15min,收集沉淀,重悬于EQBuffer中,得到镍珠悬液,将其加入至所述上清中,于4℃条件下保持2h,而后以4000rpm的转速离心15min,收集沉淀,悬浮于WashBuffer中,而后在旋转混匀仪上常温旋转10min,而后以4000rpm的转速离心15min,收集沉淀,重悬于EQBuffer中,再以4000rpm的转速离心15min,收集沉淀,重悬于EQBuffer中,再以4000rpm的转速离心15min,收集沉淀;7)取步骤6)所得沉淀物悬浮于洗脱Buffer中,在旋转混匀仪上常温旋转15min,以4000rpm的转速离心15min,收集上清,再以4000rpm的转速离心15min收集上清;8)取步骤7)所得的上清液,以13000rpm的转速离心30~60min,取上清装入透析袋,先利用1×PBS缓冲液透析3h,再用25%体积浓度的甘油水溶液透析3h,即得到所述pBpp蛋白。作为优选,步骤5)中,初始向培养基中接入的重组表达菌株pET28c-pBpp-BL21菌液量为培养基体积的1%。作为优选,步骤5)中培养至培养液OD值为0.6时向其中加入终浓度为1mmol/L的IPTG,于25℃条件下诱导6~8h,结束培养。作为优选,步骤6)中所述的超声破碎,直至溶液澄清为止。作为优选,步骤6)中所述的以4000rpm的转速离心15min,被离心物均是装满于15ml离心管中进行离心的。作为优选,步骤6)镍珠在EQBuffer中的悬浮,二者的体积比为1:15。作为优选,步骤8)利用1×PBS缓冲液透析3h的过程中,先后更换PBS缓冲液3次。同时,本专利技术还提供了一种上述pBpp蛋白的功能验证方法,包括以下步骤:1)取小鼠,连续5d以每天50mg/kg的剂量注射链脲佐菌素,得到II型糖尿病模型小鼠;2)取所述pBpp蛋白,以尾静脉注射方式对步骤1)所得的II型糖尿病模型小鼠给药,每隔7天监测所述II型糖尿病模型小鼠的血糖变化。本专利技术提供了一种基于大肠杆菌表达系统的重组pBpp蛋白制备方法,该技术方案以斑马鱼粪便菌群DNA为模板,扩增得到pBpp表达基因,再利用pET28c质粒为载体,先于大肠杆菌TOP10中扩增质粒,而后转化入大肠杆菌BL21中进行蛋白表达。在此基础上,本专利技术针对重组菌株的特性设计了适宜的蛋白表达及诱导条件,对于胞内表达的pBpp蛋白,本专利技术对菌体进行超声破碎后,先利用镍珠结合游离的蛋白,再进行蛋白洗脱,最后分别利用PBS和甘油进行透析,从而实现了pBpp蛋白的有效纯化。在此基础上,为考察pBpp蛋白的降糖效果,本专利技术建立了相应的功能验证方法,该方法先利用链脲佐菌素构建II型糖尿病模型小鼠,而后采用尾静脉注射的方式进行pBpp蛋白给药,以给药后小鼠血糖变化情况来对pBpp蛋白的降糖效果进行分析。实验发现,本专利技术所制备的pBpp蛋白可确切诱导胰腺中β细胞的增殖,从而对因胰岛β细胞损伤所导致的糖尿病起到治疗效果。具体实施方式以下将对本专利技术的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节,在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。除有定义外,以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本专利技术所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂耗材,如无特殊说明,均为常规生化试剂;所述实验方法,如无特殊说明,均为常规方法;以下实施例中的定量试验,均设置三次重复实验,结果取平均值;以下实施例中的%,如无特别说明,均为质量百分含量。以下实施例中,所用到的E.coli本文档来自技高网
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【技术保护点】
一种基于大肠杆菌表达系统的重组pBpp蛋白制备方法,其特征在于包括以下步骤:1)以斑马鱼粪便菌群的总DNA为模板,以序列如SEQ ID No.1所示和序列如SEQ ID No.2所示的片段分别为上、下游引物执行PCR扩增,得到序列如SEQ ID No.3所示的DNA片段,即为pBpp蛋白表达基因;2)取步骤1)所获得的pBpp蛋白表达基因,先经NcoI和XhoI双酶切,酶切产物纯化后采用T4连接酶连接到pET28c上,即得到重组质粒pET28c‑pBpp;3)取步骤2)所得的重组质粒pET28c‑pBpp,转入大肠杆菌E.coli Top10中,得到重组菌株;4)培养步骤3)所得的重组菌株,从中提取重组质粒pET28c‑pBpp,将其转化入大肠杆菌E.coli BL21,即得到重组表达菌株pET28c‑pBpp‑BL21;5)利用含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基培养步骤4)所得的重组表达菌株pET28c‑pBpp‑BL21,收集菌体;6)利用EQ Buffer重悬步骤5)所得菌体,超声破碎,而后以10000rpm的转速离心10min,取上清;取镍珠,悬浮于EQ Buffer中,以4000rpm的转速离心15min,收集沉淀,悬浮于EQ Buffer中,再以4000rpm的转速离心15min,收集沉淀,重悬于EQ Buffer中,得到镍珠悬液,将其加入至所述上清中,于4℃条件下保持2h,而后以4000rpm的转速离心15min,收集沉淀,悬浮于Wash Buffer中,而后在旋转混匀仪上常温旋转10min,而后以4000rpm的转速离心15min,收集沉淀,重悬于EQ Buffer中,再以4000rpm的转速离心15min,收集沉淀,重悬于EQ Buffer中,再以4000rpm的转速离心15min,收集沉淀;7)取步骤6)所得沉淀物悬浮于洗脱Buffer中,在旋转混匀仪上常温旋转15min,以4000rpm的转速离心15min,收集上清,再以4000rpm的转速离心15min收集上清;8)取步骤7)所得的上清液,以13000rpm的转速离心30~60min,取上清装入透析袋,先利用1×PBS缓冲液透析3h,再用25%体积浓度的甘油水溶液透析3h,即得到所述pBpp蛋白。...

【技术特征摘要】
1.一种基于大肠杆菌表达系统的重组pBpp蛋白制备方法,其特征在于包括以下步骤:1)以斑马鱼粪便菌群的总DNA为模板,以序列如SEQIDNo.1所示和序列如SEQIDNo.2所示的片段分别为上、下游引物执行PCR扩增,得到序列如SEQIDNo.3所示的DNA片段,即为pBpp蛋白表达基因;2)取步骤1)所获得的pBpp蛋白表达基因,先经NcoI和XhoI双酶切,酶切产物纯化后采用T4连接酶连接到pET28c上,即得到重组质粒pET28c-pBpp;3)取步骤2)所得的重组质粒pET28c-pBpp,转入大肠杆菌E.coliTop10中,得到重组菌株;4)培养步骤3)所得的重组菌株,从中提取重组质粒pET28c-pBpp,将其转化入大肠杆菌E.coliBL21,即得到重组表达菌株pET28c-pBpp-BL21;5)利用含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基培养步骤4)所得的重组表达菌株pET28c-pBpp-BL21,收集菌体;6)利用EQBuffer重悬步骤5)所得菌体,超声破碎,而后以10000rpm的转速离心10min,取上清;取镍珠,悬浮于EQBuffer中,以4000rpm的转速离心15min,收集沉淀,悬浮于EQBuffer中,再以4000rpm的转速离心15min,收集沉淀,重悬于EQBuffer中,得到镍珠悬液,将其加入至所述上清中,于4℃条件下保持2h,而后以4000rpm的转速离心15min,收集沉淀,悬浮于WashBuffer中,而后在旋转混匀仪上常温旋转10min,而后以400...

【专利技术属性】
技术研发人员:陈廷涛辛洪波王鑫
申请(专利权)人:南昌大学
类型:发明
国别省市:江西,36

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