新、支、流三联灭活疫苗的佐剂及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种新、支、流三联灭活疫苗的佐剂，其特征在于：所述佐剂为囊素三肽。本发明专利技术还提供了该佐剂的应用。本发明专利技术利用囊素三肽具有免疫增强作用的特点，将囊素三肽作为新、支、流三联灭活疫苗的佐剂。囊素三肽从SPF鸡的法氏囊中天然提取，不仅绿色安全，而且价格低廉容易得到。同时，囊素三肽以冷冻干燥后的冻干粉形式保存，可根据需要稀释成生理盐水溶液，质量稳定，易于保存。并且囊素三肽不与家禽机体自身交叉免疫，又可以提高疫苗的免疫应答、抗体水平以及家禽体重，效果显著，具有很强的实用性。

The new branch, three, adjuvant vaccine and its application

Adjuvant of the present invention provides a new branch, and three combined inactivated vaccine, which is characterized in that the adjuvant for bursin peptide three. The present invention also provides the use of the adjuvant. The invention uses three bursin peptide has the characteristics of the role of immune enhancement, the bursin peptide as adjuvant, three new branches, three combined inactivated vaccine. The biotin three peptide, extracted naturally from the bursa of SPF, is not only green and safe, but also inexpensive and easy to obtain. At the same time, the peptide three can be preserved in freeze-dried powder, and can be diluted into normal saline solution as required. The quality is stable and easy to preserve. Moreover, the peptide three peptide does not cross immune with the poultry body itself, and can enhance the immune response, the antibody level and the poultry weight of the vaccine, and the effect is remarkable, and the utility model has the advantages of practicability.

【技术实现步骤摘要】
新、支、流三联灭活疫苗的佐剂及其应用
本专利技术涉及家禽疫苗的
，具体是指一种新、支、流三联灭活疫苗的佐剂及其应用。
技术介绍
由于畜禽养殖业普遍使用规模化和集约化的养殖方式，目前畜禽群体存在着免疫功能低下和免疫水平不高的重要问题。而被称为新、支、流的鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感更是家禽养殖业亟需解决的主要问题。鸡新城疫是由病毒引起的一种急性败血性传染病。俗称“鸡瘟”，即所谓亚洲鸡瘟。各种日龄的鸡均能感染，20日龄-60日龄鸡最易感，死亡率也高。鸡传染性支气管炎是由传染性支气管炎病毒引起的鸡的一种急性高度接触性呼吸道传染病。产蛋鸡感染通常发现产蛋量降低，蛋的品质下降。本病广泛流行于世界各地，是养鸡业的重要疫病。而禽流感是由A型禽流感病毒引起的一种病毒性传染病。由于本病发病急、流行广、死亡快且危害大，对养禽业具有毁灭性的打击，所以国际兽医局(OIE)和我国农业部将其列为一类传染病。为了解决上述家禽的新、支、流问题，现有技术一般采用家禽注射新、支、流三联灭活疫苗来增加家禽的免疫水平。但是单独使用灭活疫苗免疫家禽具有以下缺陷：注射疫苗后家禽的免疫水平不高，甚至会出现免疫抑制的现象；注射后家禽的体重增长程度小，生产性能受到影响。因此常用的三联灭活疫苗中一般会加入佐剂，如中国专利CN101112617A“新、支、流H9亚型三联灭活疫苗的制备方法”中公开的，佐剂一般选择白油佐剂、吐温-80等。但是提高疫苗的免疫应答不明显，增加家禽的免疫水平效果有限。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了进一步提高疫苗的免疫应答，增加家禽的免疫水平，提供一种鸡新城疫-传染性支气管炎-禽流感三联灭活疫苗的佐剂。本专利技术的另一个目的是提供上述鸡新城疫-传染性支气管炎-禽流感三联灭活疫苗佐剂的应用。为实现上述目的，本专利技术技术方案如下：一种鸡新城疫-传染性支气管炎-禽流感三联灭活疫苗的佐剂，其特征在于：所述佐剂为囊素三肽。所述囊素三肽是经过如下工艺得到的：SPF鸡的法氏囊匀浆→破碎细胞→分离液体并浓缩、除菌→冷冻干燥后得到的。优选的，所述匀浆是通过研磨匀浆。优选的，所述破碎细胞是通过冻融2-5次实现的。优选的，所述分离液体并浓缩是先将破碎后的细胞离心后取上层清液，然后进行超滤浓缩。本专利技术优选的技术方案为：一种鸡新城疫-传染性支气管炎-禽流感三联灭活疫苗的佐剂，其特征在于：所述佐剂为囊素三肽。所述囊素三肽是经过如下工艺得到的：SPF鸡的法氏囊研磨匀浆→冻融2-5次使破碎细胞→将破碎后的细胞离心后取上层清液，然后进行超滤浓缩、除菌→冷冻干燥后得到的。本专利技术的另一个目的是通过如下技术方案实现的：一种上述鸡新城疫-传染性支气管炎-禽流感三联灭活疫苗佐剂的应用，其特征在于：所述佐剂按照每羽份三联灭活疫苗加入10-100μg佐剂的方式添加到三联灭活疫苗中。优选每羽份三联灭活疫苗为0.3mL。优选的，所述佐剂用生理盐水稀释至浓度为10-100μg/mL，再添加到三联灭活疫苗中。本专利技术利用囊素三肽具有免疫增强作用的特点，将囊素三肽作为新、支、流三联灭活疫苗的佐剂。囊素三肽从SPF鸡的法氏囊中天然提取，不仅绿色安全，而且价格低廉容易得到。同时，囊素三肽以冷冻干燥后的冻干粉形式保存，可根据需要稀释成生理盐水溶液，质量稳定，易于保存。并且囊素三肽不与家禽机体自身交叉免疫，又可以提高疫苗的免疫应答、抗体水平以及家禽体重，效果显著，具有很强的实用性。具体实施方式以下结合具体实施例进一步说明本专利技术：实施例1(1)在超净台中无菌采集SPF鸡的法氏囊，用剪刀将其剪成小块后放于4mL无菌EP管中，然后加入研磨珠在组织研磨器上进行研磨，180rm研磨3分钟；(2)将研磨液收集到一起，密封后放于-70℃超低温冰箱中冻存，待其完全冻结后再取出解冻，如此反复冻融3次，使其细胞破碎；(3)在4℃离心机中6000r/min离心10min，收集上清液，加入到超滤管中进行超滤浓缩；(4)将浓缩后的液体用0.22μm滤膜过滤并除菌，得到囊素三肽溶液；(5)将得到的囊素三肽溶液用真空冷冻干燥机冻干至恒重，即得囊素三肽冻干粉。采用高压液相法测定上述囊素三肽样品的纯度和出峰时间。将囊素三肽冻干粉用无菌生理盐水稀释至浓度为100μg/mL，然后采用C18柱，用溶液A(含0.1％三氟乙酸乙酯的乙腈溶液)和溶液B(含0.1％三氟乙酸乙酯的水溶液)进行梯度洗脱，流速为1.0mL/min，检测波长220nm，进样量为20μL。样品出峰时间为2.9min，峰面积为717725.11，样品所占比重为87.5％。采用ESI液质联用法测定样本的分子量，测得分子量为338。与囊素三肽分子量相似，且此物质占样本的比重较大，为95％。以下实施例中实验用家禽为3-5周龄的SPF鸡，购自济南斯帕法斯家禽有限公司。采用的鸡新城疫-传染性支气管炎-禽流感三联灭活疫苗为：按照《中华人民共和国兽用生物制品规程》(2000年版)中所述的方法和标准由上海海利生物技术股份有限公司制备得到的，每羽份疫苗为0.3mL。应用实施例1取实施例1中制备得到的囊素三肽的冻干粉，用无菌生理盐水稀释至浓度为100μg/mL，再用0.22μm的滤膜过滤除菌。实验用家禽为免疫组和对照组各10只SPF鸡。其中免疫组的10只SPF鸡在鸡翅部注射0.3mL稀释后的囊素三肽生理盐水溶液，对照组的10只SPF鸡在同样部位注射0.3mL无菌生理盐水。观察35天后，实验结果见表1。表1安全性实验结果分组SPF鸡不良反应健活数免疫组10无10对照组10无10安全性实验结果显示，免疫组和对照组均无局部或全身不良反应且全部健活，说明囊素三肽对SPF鸡是安全的。应用实施例2取实施例1中制备得到的囊素三肽的冻干粉，用无菌生理盐水稀释至浓度分别为10、50、100μg/mL，再用0.22μm的滤膜分别过滤除菌。将SPF鸡随机分为5组，每组10只，分组与免疫处理情况如表2所示，其中：(1)组A、B和C为添加佐剂囊素三肽的疫苗试验组，分别在1羽份鸡新城疫-传染性支气管炎-禽流感三联灭活疫苗中加入1mL的佐剂囊素三肽后注射0.3mL到SPF鸡的鸡翅部；(2)组D为无佐剂疫苗对照组，准备1羽份鸡新城疫-传染性支气管炎-禽流感三联灭活疫苗后加入灭菌生理盐水1mL，然后注射0.3mL到SPF鸡的鸡翅部；(3)组E为非免疫空白对照组，准备灭菌生理盐水，然后注射0.3mL到SPF鸡的鸡翅部。在注射后14，21，28和35天分别称量各组SPF鸡的体重并于翅静脉采血，分离血清，然后检测H1抗体水平。H1抗体水平实验结果见表3，平均体重实验结果见表4。表2分组与免疫处理情况表3各组H1抗体水平实验结果通过表3可以看出，对SPF鸡注射后14-35天测试，使用了本专利技术佐剂的疫苗免疫组A、B、C组，SPF鸡的H1抗体水平显著高于无佐剂疫苗对照组D组的SPF鸡H1抗体水平，无疫苗的空白对照组E组几乎没有H1抗体。免疫35天时，试验组A的H1抗体效价分别为9.8、10.4、9.1，试验组B的H1抗体效价分别为9.1、9.8、9.1，试验组C的H1抗体效价分别为8.9、9.4、9.0，显著高于无佐剂疫苗免疫组的鸡H1抗体效价8.2、8.3、7.7。说明对SPF鸡注射三联灭活疫苗可以提高抗体水平。而添加了本本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种新、支、流三联灭活疫苗的佐剂，其特征在于：所述佐剂为囊素三肽。

【技术特征摘要】
1.一种新、支、流三联灭活疫苗的佐剂，其特征在于：所述佐剂为囊素三肽。2.根据权利要求1所述的佐剂，其特征在于：所述囊素三肽是经过如下工艺得到的：SPF鸡的法氏囊匀浆→破碎细胞→分离液体并浓缩、除菌→冷冻干燥后得到的。3.根据权利要求2所述的佐剂，其特征在于：所述匀浆是通过研磨匀浆。4.根据权利要求2所述的佐剂，其特征在于：所述破碎细胞是通过冻融2-5次实现的。5.根据权利要求2所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵有淑，刘阳坤，
申请(专利权)人：上海海利生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31