本发明专利技术提供了一种基于核酸适配体检测miRNA‑155的方法，本发明专利技术是基于核酸适配体与目标物的特异性识别，利用phi29 DNA聚合酶在滚环扩增中的链延伸作用以及核酸内切酶在特异性位点对核酸链的切割作用以及分子信标的荧光基团能够产生荧光信号的特性构建了该生物检测方法。该检测方法具有检测速度快，检测限低，特异性高等优点，可以弥补miRNA‑155现有检测方法的缺陷与不足，实现对其快速，准确的定量检测。
Methods the aptamer detection based on miRNA 155
The present invention provides a method for aptamer detection based on miRNA 155, the invention is the specific recognition of aptamer and target based on the use of phi29 DNA polymerase chain amplification in the rolling ring in the extension and characteristics of endonuclease in specific sites of nucleic acid chain cutting and molecular beacon the fluorophore can produce fluorescence signal method to construct the biological detection. The detection method has fast detection speed and low detection limit, higher specific advantages, can make up the defects of miRNA 155 existing detection methods and shortcomings, to realize the rapid and accurate detection.
【技术实现步骤摘要】
基于核酸适配体检测miRNA-155的方法
本专利技术涉及生物技术检测
，特别涉及基于核酸适配体检测miR-155的方法。
技术介绍
MiRNA是一类长度为17-25个核苷酸的非编码RNA分子，其在肿瘤发生、细胞分化、细胞凋亡和蛋白质合成等生命现象中扮演着重要的角色。miRNA的异常表达与人类多种疾病如癌症，糖尿病，心血管疾病和神经病症等直接相关，因此miRNA已经成为对于癌症等多种疾病进行早期预防和诊断的重要生物标志物。miRNA-155作为miRNA的一种，它的过量表达将会导致乳腺癌的发生，因此通过对miR-155的高灵敏检测来实现对乳腺癌的早期诊断和预防是非常有必要的。目前报道的对于miR-155的检测方法包括实时定量PCR法、Northern印迹杂交、基因芯片检测等方法，这些方法往往存在仪器昂贵、分析周期长、样品预处理复杂、检测费用昂贵、检测灵敏度低等问题，已经难以满足对miR-155进行方便、快捷、高灵敏检测的要求。因此，目前急需建立一种快速，准确，灵敏度高且特异性强的检测方法来对miR-155进行检测，以实现对乳腺癌的早期诊断和预防。
技术实现思路
本专利技术基于核酸适配体与目标物的特异性识别，利用phi29DNA聚合酶在滚环扩增中的链延伸作用以及核酸内切酶在特异性位点对核酸链的切割作用以及分子信标的荧光基团能够产生荧光信号的特性构建了该生物检测方法。该检测方法具有检测速度快，检测限低，特异性高等优点，可以弥补miRNA-155现有检测方法的缺陷与不足，实现对其快速，准确的定量检测。本专利技术中一共用到了4种DNA链和1种分子信标，其序列分别是：Circulartemplate1:5’-P-CCCCTATATAGAAGTCTGATAGCACAGACGCGCCATCGATAGGCGTGGAGCATTACCCGTGGCTTCTTCGTACTAG-3’(SEQIDNO:1)；Circulartemplate2:5’-P-AAGTAGTCTATTGGTCGGATCTGGAGGTTGCATGTGCTGAGGCGAATTTAACGACCCACACCGAATACAA-3’(SEQIDNO:2)；Hairpin1:5’-CCCCTATCACGATTAGCATTAACATTGAGGATTTCTATATAGGGG-3’(SEQIDNO:3)；Hairpin2:5’-TGGAGCATTACCCGTTTTTACCTCCAGA-3’(SEQIDNO:4)；Molecularbeacon:5’-FAM-CATGTGCTGAGGCGTTTCACATG-Dabcyl-3’(SEQIDNO:5)。其中在Hairpin1结构的序列中，5’端画横线的部分为目标物miRNA-155的适配体，可以与目标物通过碱基互补配对作用而紧密结合，因而可以将Hairpin1打开然后释放出它的3’端从而进行下一步的反应。Molecularbeacon的5’端修饰有荧光基团，3’端修饰有猝灭基团，由于其自身能维持发夹型结构，因此就使荧光基团和猝灭基团临近，因而在激发波的作用下无法检测到荧光信号或者荧光信号很弱；如果将发夹型的分子信标打开或者将其切断使得荧光基团和猝灭基团远离，在激发波的作用下就会检测到强烈的荧光信号，我们就是通过检测荧光信号的强度来达到定量检测目标物的目的。本专利技术中用到了两种酶：phi29DNA聚合酶和Nb.BbvCI核酸内切酶。phi29DNA聚合酶具有链延伸的功能；核酸内切酶可以在特异性位点实现对DNA双链的特异性切割，其特异性的切割识别序列是:5’---GCTGAGG---3’，切割位点位于靠近5’端的第二个和第三个碱基之间。本专利技术中miRNA-155的检测是在均相溶液中实现的，通过利用三步信号放大技术来实现对目标物的高灵敏检测，并获得较低的检测下限。均相中发生的反应主要有：发夹结构的Hairpin1中有目标物的适配体，在有目标物存在的情况下，该适配体序列能够特异性的识别目标物并与之结合，发生构型转变，从而将发夹结构的Hairpin1打开并且释放出Hairpin1的3’端，释放出的Hairpin1的3’端能够与Circulartemplate1的一段核酸序列互补配对，在phi29DNA聚合酶和dNTPs的作用下进行第一步滚环扩增反应，从而产生一段单链DNA。这一段单链DNA又能够打开大量的发夹型Hairpin2进而释放出Hairpin2的3’端，然后释放出的Hairpin2的3’端又能够与Circulartemplate2的一段核酸序列互补配对，从而进行第二步滚环扩增反应，并且释放出一条长的单链DNA序列。作为第二步滚环扩增反应的产物，这一条长的单链DNA序列又能够打开发夹状的分子信标，使得修饰在分子信标5’端和3’端的荧光基团和猝灭基团分离，从而能够产生荧光信号。同时，被打开的分子信标又会暴露出一种核酸内切酶（Nb.BbvCI）的酶切位点,从而将结合在第二次滚环扩增产生的单链DNA上的MB切割后将MB释放下来，然后第二次滚环扩增所产生的单链又能够进行下一步的反应，最终不断地将MB打开、切割、释放从而实现第三步信号放大反应，产生强烈的荧光信号。在均相反应中，反应条件为37℃，反应时间是70min。该专利技术的检测方式是荧光检测，利用的是一台安捷伦荧光分析仪。所有分析检测过程中激发波、发射波的狭缝都为5nm，电压为950V，激发波为486nm，在发射光谱的518nm处获得发射波的强度，根据不同的荧光强度来检测目标物miRNA-155的浓度。具体检测方法如下：1）将1μL，1.0μM的Hairpin1，1μL，1.0μM的Circulartemplate1,1μL，1.0μM的Hairpin2，1μL，1.0μM的Circulartemplate2，Molecularbeacon（1μL，1.0μM），1μL，10×的phi29DNA聚合酶，1μL，10×的Nb.BbvCI,NEBbuffer(5μL，10×)和待测物加入到EP管中，震荡30s，放入37℃的水浴锅中反应70min；2）将反应好的溶液从水浴锅中取出，放入85℃的水浴锅中水浴加热10min，使体系中的酶失活；3）10min后，从水浴锅中取出混合溶液，然后用安捷伦荧光检测仪测定混合溶液的荧光强度，据此检测目标物。有益效果1、通过利用碱基互补配对原则，使得核酸适配体能够高特异性地识别目标物miRNA-155，最终实现了对其的高特异性检测；2、利用了三步信号放大技术极大地增强了荧光信号，从而提高了检测的灵敏度，实现对目标物miRNA-155的高灵敏检测；3、该生物传感器的检测反应过程均是在均相中进行的，提高了反应速度，降低了操作的复杂程度，实现了对目标物的快速，简单，灵敏的检测；4、制备方法简单，性能稳定，重复性好，适用于人体组织中miRNA-155的检测和生物传感器产业化的实际应用；5、制作该生物传感器的工艺成本低，符合产业化中价格价廉的要求。附图说明图1为该实验的原理图；图2为实施例1Hairpin1浓度优化检测结果图；图3为实施例2Circulartemplate1浓度优化检测结果图；图4为实施例3Hairpin2浓度优化检测结果图；图5为实施例4Circulart本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于核酸适配体检测miR‑155的方法，其特征在于，包括如下步骤：1) 将1μL， 1.0μM 的Hairpin1，1μL，1.0μM 的Circular template 1, 1μL，1.0μM 的Hairpin2， 1μL，1.0μM的 Circular template 2，1μL，1.0μM Molecular beacon，1μL，10×的phi29 DNA聚合酶，1μL，10×的
【技术特征摘要】
1.一种基于核酸适配体检测miR-155的方法，其特征在于，包括如下步骤：1)将1μL，1.0μM的Hairpin1，1μL，1.0μM的Circulartemplate1,1μL，1.0μM的Hairpin2，1μL，1.0μM的Circulartemplate2，1μL，1.0μMMolecularbeacon，1μL，10×的phi29DNA聚合酶，1μL，10×的Nb.BbvCI，5μL，10×NEBbuffer和待测物加入到EP管中，震荡30s，放入37℃的水浴锅中反应70min；2）...
【专利技术属性】
技术研发人员：李慧，徐成功，王玉，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：山东,37
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