一种microRNA及其小分子抑制剂在抑制肺腺癌干细胞特性中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种microRNA及其小分子抑制剂在抑制肺腺癌干细胞特性中的应用。本发明专利技术发现hsa‑miR‑448的表达有助于肺腺癌SPCA‑1细胞的增殖，有助于维持肺腺癌SPCA‑1干细胞特性；通过靶向下调hsa‑miR‑448的表达可以有效抑制肺腺癌SPCA‑1细胞的增殖，同时降低其干细胞特性。雪胆素甲、雪胆素乙和辛夷脂素为hsa‑miR‑448的有效抑制剂，体内外均可以有效抑制肺腺癌SPCA‑1细胞的增殖。本发明专利技术首次揭露hsa‑miR‑448与肺腺癌增殖及其干细胞特性之间的关系，并产生了有益的技术效果，具有突出的实质性特点和显著的进步。

Use of microRNA and its small molecule inhibitors in inhibiting lung adenocarcinoma stem cell characteristics

The present invention discloses the use of microRNA and its small molecule inhibitors in inhibiting the characteristics of lung adenocarcinoma stem cells. The present invention found the expression of HSA miR 448 helps 1 lung adenocarcinoma SPCA cell proliferation, contribute to the maintenance of lung adenocarcinoma SPCA 1 Characteristics of stem cells; can effectively inhibit the lung adenocarcinoma SPCA 1 cells to downregulate the expression of HSA miR 448 by targeting proliferation, while reducing its stem cell character. Hemslecin a, B hemsleyin and fargesin HSA miR effective inhibitor 448, both in vitro and in vivo can effectively inhibit the lung adenocarcinoma SPCA cell proliferation 1. The first HSA miR 448 and revealed lung adenocarcinoma proliferation and stem cell characteristics between, and produce a useful technical effect, has prominent substantive features and obvious progress.

【技术实现步骤摘要】
一种microRNA及其小分子抑制剂在抑制肺腺癌干细胞特性中的应用
本专利技术属于基因治疗药物领域，具体涉及一种microRNA及其小分子抑制剂在抑制肺腺癌干细胞特性中的应用。
技术介绍
肺癌是全球最常见的恶性肿瘤，死亡率居恶性肿瘤之首。我国肺癌发病率呈现逐年上升趋势，年平均增长近2％。肺癌根据病理学特点的不同分为多种组织类型，肺癌组织类型不同，其治疗措施也不同。根据2004版WHO分类，常见肺癌组织病理学分型分为非小细胞癌(NSCLC)和小细胞癌(SCLC)。非小细胞癌又分为鳞状细胞癌(SCC)、腺癌(AC)和大细胞癌(LCC)。不同肺癌临床治疗方案不同，预后效果也不同。因此，为了提高治疗效果，肺癌的治疗策略已经从传统的以分期为基础的治疗模式转变为以组织学类型和基因突变为指导的个体化、精准的多学科治疗模式。个体化治疗提高了肺癌的治疗和预后效果。腺癌作为最常见的肺癌组织学类型，在全球及我国发病率均呈上升趋势。流行病学研究结果显示，非小细胞肺癌的发病有明显的性别差异，尤其是腺癌。腺癌占原发肺癌的50％，是非吸烟患者的主要组织学类型。肿瘤干细胞理论的出现，无疑为肿瘤的防治提供了新思维。该理论认为恶性肿瘤组织中并不是所有肿瘤细胞都具有恶性特征，普通肿瘤细胞经过数次短暂的分化后，即便没有放化疗等外界干预，最终也会走向死亡；仅少量肿瘤干细胞在恶性肿瘤的发生发展过程中起着关键性的作用，肿瘤干细胞具有无限增殖和多潜能分化、自我更新、高度侵袭性和成瘤性、抗凋亡及抗拒化放疗等特点，是肿瘤发生、转移和复发的根源，因此针对肿瘤干细胞的治疗才能从根本上治愈肿瘤。MicroRNA(miRNA)是一类内生的、长度约为20-24个核苷酸的小RNA，广泛分布于人体各种组织器官，是人类基因组中最大的基因家族之一，其在细胞内具有多种重要的调节作用。药物靶点的研究一直是新药研发中最重要的内容之一，miRNA作为广泛参与基因表达调控的分子，无疑是药物靶点研究的重要对象。例如，针对癌症中的单一蛋白的抗癌药物在临床使用中具有一定局限性，尽管联合治疗可弥补其不足，但这常会涉及药物之间的相互作用所带来的副作用，并导致治疗方案复杂化。与之相比，miRNA具备调控多个靶基因的天然特性，处于多靶点调控网络的中心。总体而言，miRNA调控基因方式是多对多的，一个mRNA可以被多个miRNA调控；一个miRNA分子也可以有多个调控靶点。同一个miRNA可以在一个细胞里同时调控多个靶基因来影响该细胞的生长发育，也可以通过对不同细胞中不同的靶基因的调控使得不同的细胞行使不同的功能，如miR-221，不仅具有调节人血液系统、血管生成、乳腺发育等相关功能，还与肝癌、乳腺癌、甲状腺癌等癌症相关。因此多靶点调控分子miRNA作为药物靶点，在新药研发中越来越受到关注。以miRNA为靶点寻找和发现特异性抑制剂，逐渐成为miRNA研究的重要部分。目前广泛使用的miRNA抑制剂主要为经过修饰的核苷酸寡聚物，而针对miRNA的化学小分子抑制剂的研究还处在起步阶段。目前，尚未有研究揭露hsa-miR-448与肺腺癌干细胞之间的关系。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种microRNA及其小分子抑制剂在抑制肺腺癌干细胞特性中的应用；本专利技术第二目的在于提供一种治疗肺腺癌的药物。上述目的是通过如下技术方案实现的：一种微小RNAhsa-miR-448作为药物靶标在筛选制备治疗肺腺癌的药物中的应用。微小RNAhsa-miR-448的抑制剂在制备治疗肺腺癌的药物中的应用。优选地，所述抑制剂为雪胆素甲。优选地，所述抑制剂为雪胆素乙。优选地，所述抑制剂为辛夷脂素。一种用于治疗肺腺癌的药物，含有上述抑制剂。本专利技术的有益效果：本专利技术发现hsa-miR-448的表达有助于肺腺癌SPCA-1细胞的增殖，有助于维持肺腺癌SPCA-1干细胞特性；通过靶向下调hsa-miR-448的表达可以有效抑制肺腺癌SPCA-1细胞的增殖，同时降低其干细胞特性。雪胆素甲、雪胆素乙和辛夷脂素为hsa-miR-448的有效抑制剂，体内外均可以有效抑制肺腺癌SPCA-1细胞的增殖。附图说明图1为转染后各组细胞相对增殖活力；图2为转染后各组CD133+细胞的比率及干细胞特性基因OCT4mRNA和蛋白表达水平。具体实施方式下面结合具体实施例和附图详细介绍本专利技术的技术方案和技术效果。未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如教科书和实验指南中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件，为本领域普通技术人员熟知或易于获知。实施例1hsa-miR-448表达对肺腺癌细胞的影响一、实验材料hsa-miR-448模拟物hsa-miR-448mimics、阻遏物hsa-miR-448inhibitor、hsa-miR-448模拟物阴性对照hsa-miR-448mimicsnegativecontrol和阻遏物阴性对照hsa-miR-448inhibitornegativecontrol购自广州市锐博生物科技有限公司。PCR引物委托广州市锐博生物科技有限公司设计合成。TRIzol试剂和转染试剂Lipofectamine2000购于Invitrogen公司。肺腺癌SPCA-1细胞株为本公司长期冻存。RPMI1640培养基和胎牛血清购于Gibco公司。肺腺癌SPCA-1细胞株用含有10％胎牛血清的RPMI1640培养基按常规方法培养。BCA蛋白浓度测定试剂盒购自西安赫特生物技术有限公司。OCT4、β-actin一抗购于Abcam公司，HRP标记的二抗购于北京中杉金桥生物科技有限公司，CD133一抗购于CellSignalingTechnology公司，FITC标记的二抗购于美国KPL公司。CCK-8试剂盒购于南京凯基生物有限公司。miRcutemiRNA提取分离试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，RNeasyMiniKit总RNA提取试剂盒购自杭州沃森生物技术有限公司，RNA逆转录试剂盒购自TaKaRa公司，Real-timePCR试剂盒购自TaKaRa公司。二、实验方法1、细胞培养及转染肺腺癌SPCA-1细胞株用含有10％胎牛血清的RPMI1640培养基按常规方法培养。将SPCA-1细胞分为5组，即hsa-miR-448模拟物转染组、阻遏物转染组、模拟物阴性对照转染组、阻遏物阴性对照转染组和只加转染试剂的空白对照组。转染在六孔细胞培养板内、待细胞结合度75％左右进行，每孔板加入25pmol的模拟物或阻遏物或阴性对照和10μL的转染试剂，使模拟物或阻遏物或阴性对照的终浓度为10pmol/mL，转染后5h换液。转染过程严格按照转染试剂Lipofectamine2000的操作说明进行。2、RT-PCR法检测hsa-miR-448表达水平在转染后48h收获细胞，按照miRcutemiRNA提取分离试剂盒所提供的步骤提取miRNA。用紫外分光光度仪测定所提取RNA的浓度及纯度，之后按照TaKaRa逆转录试剂盒所提供的步骤将其逆转录为cDNA，反应条件：25℃×30min，42℃×30min，85℃×5min。以cDNA为模板，按照TaKaRaRT-PCR试剂盒提供的步骤加入相关试剂及hsa-miR-448引物，以U6为内参，在ABI-73本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种微小RNAhsa‑miR‑448作为药物靶标在筛选制备治疗肺腺癌的药物中的应用。

【技术特征摘要】
1.一种微小RNAhsa-miR-448作为药物靶标在筛选制备治疗肺腺癌的药物中的应用。2.微小RNAhsa-miR-448的抑制剂在制备治疗肺腺癌的药物中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述抑制剂...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭守河，张红，
申请(专利权)人：南京九寿堂医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32