一种血小板抗体特异性鉴别方法及其试剂盒技术

本发明专利技术提供了一种血小板抗体特异性鉴别方法及其试剂盒，包括如下步骤：(1)将不同的血小板特异性糖蛋白连接在不同的荧光微球表面，得到抗原特异性荧光微球，备用；(2)将抗原特异性荧光微球加入到待测样本中进行孵育反应，洗涤，备用；(3)向步骤(2)中加入荧光标记的抗人IgG进行孵育反应、洗涤，然后进行流式细胞检测；所述的血小板抗体特异性鉴别方法，解决了现有技术中的血小板抗体检测主要针对血小板表面的抗原‑自身血小板抗体复合物，其检测的并非血浆或血清中游离的血小板抗体，检测血小板抗体的结果不精确的问题，且本发明专利技术所述方法步骤简单，易操作，耗时短，效率更高。

Platelet antibody specific identification method and reagent kit thereof

The present invention provides a method for identification of platelet specific antibody and kit, which comprises the following steps: (1) glycoprotein of platelet specific connection in different fluorescent microspheres with different surface antigen, specific fluorescent microspheres, get back; (2) the antigen specific fluorescent microspheres into the sample of hatch with reaction, washing, standby; (3) to step (2) with fluorescence labeled anti human IgG was incubated with reaction, washing, and then flow cytometry; specific method for the identification of the platelet antibody, solves the detection of platelet antibody technology focused on platelet surface antigen the platelet antibody complexes, the detection of platelet antibody free not in plasma or serum, the detection of platelet antibody is not accurate, and the method of the invention is simple steps Single, easy to operate, time-consuming and efficient.

【技术实现步骤摘要】
一种血小板抗体特异性鉴别方法及其试剂盒
本专利技术涉及医学检验领域，特别是涉及一种血小板抗体特异性鉴别方法及其试剂盒。
技术介绍
血小板抗体是患者在输血、妊娠或移植等过程中接触外来血小板抗原所产生的致病性抗体，可致敏血小板并使其遭破坏，引起血小板减少，导致血小板输注无效症(plalelettransfusionrefractoriness，PTR)，胎母同种异体免疫血小板减少症(foetal-maternalalloimmunethromLocytepenia，FMAIT)，输血后紫癜(posttransfusionpurpura，PTP)，以及移植相关同种异体免疫血小板减少症(transplantation-associatedalloimmunethrombocytopenia，TAAT)等多种病症，患者易出现淤点、瘀斑及出血等症状，严重者甚至会发生死亡。免疫性疾病患者在机体免疫系统紊乱的情况下亦可产生针对自身血小板的抗体，导致自身免疫性血小板减少症(idiopathicthrombocytopenia，ITP)。血小板抗体包括抗HLAⅠ类抗体及抗血小板糖蛋白或HPA抗体。临床血小板相关免疫性疾病患者体内通常能检出抗HLAI类抗体。但血小板更多的是由HLAⅠ类抗体和抗GP或HPA抗体等多种抗体共同作用，包括抗HLAⅠ、抗GPⅡb/Ⅲa、抗GPⅠa/Ⅱa、抗GPⅠb/Ⅸ、抗GPⅣ抗体。为了能够准确的检测血小板抗体，如中国专利文献CN102230935A中公开的高通量荧光单抗纳米微球试剂盒，利用该试剂盒，向待测样本血小板裂解液中加入分别以牛血清白蛋白封闭连有不同单克隆抗体的荧光纳米微球进行孵育，然后再加入PBS缓冲液重悬，然后加入异硫氰酸荧光素再次孵育、重悬，然后采用流式细胞仪检测得到待测样本中的血小板抗体。然而上述方案主要针对患者体内的自身血小板抗体，即与患者血小板表面抗原结合的抗体。而临床血小板较少症患者大多数为同种异体免疫性疾病患者，此类患者真正需要检测的是血液中或血浆中游离的血小板抗体(即非自身血小板抗体)。可见上述文献中鉴别方法主要应用在自身免疫性血小板减少症患者体内的自身血小板抗体检测，不适用于检测同种异体免疫性疾病患者体内游离的血小板抗体。同时，上述文献中待测样本为血小板裂解液，其只能检测到血小板表面的血小板抗体，而无法检测血浆或血清中的游离的血小板抗体，同样导致检测结果不够精确，而且在血小板裂解过程中易导致抗原结构发生破坏，进而导致荧光微球不能与该抗原结合，进而无法检测到该抗原特异性结合的血小板抗体，造成血小板抗体的漏检，进一步导致检测结果不准确。
技术实现思路
因此，本专利技术要解决的技术问题在于克服现有技术不能检测同种异体免疫性疾病患者体内游离的血小板抗体，检测结果不准确以及检测过程复杂、效率低的问题，进而提供一种检测结果准确、检测过程简单、高效的一种血小板抗体特异性鉴别方法及其试剂盒。为此，本专利技术提供了一种血小板抗体特异性鉴别方法，包括如下步骤：包括如下步骤：(1)将不同的血小板特异性糖蛋白连接在不同的荧光微球表面，得到抗原特异性荧光微球，备用；(2)将所述抗原特异性荧光微球加入到待测样本中进行孵育反应，洗涤，备用；(3)向步骤(2)中加入荧光标记的抗人IgG进行孵育反应、洗涤，然后进行流式细胞检测。所述的鉴别方法，所述血小板特异性糖蛋白为HLAⅠ类、GPⅡb/Ⅲa、GPⅠa/Ⅱa、GPⅠb/Ⅸ和GPⅣ。所述的鉴别方法，所述HLAⅠ类糖蛋白具有A2、A11、A31、A68、B7、B18、B35和B40抗原。所述的鉴别方法，所述GPⅡb/Ⅲa糖蛋白具有HPA1a和HPA4b抗原。所述的鉴别方法，所述GPⅠa/Ⅱa糖蛋白具有HPA5a和HPA5b抗原。所述的鉴别方法，所述步骤(2)中，所述孵育条件为35-39℃，反应时间为15-45分钟。优选的，所述孵育条件为37℃，反应时间为30分钟。所述的鉴别方法，所述步骤(2)中，所述抗原特异性荧光微球与待检样本按照体积比为(0.5-1.5)：1。优选的，所述抗原特异性荧光微球与待检样本按照体积比为1：1。所述的鉴别方法，所述步骤(3)中，所述孵育条件为20-30℃，反应时间为15-25分钟。优选的，所述孵育条件为25℃，反应时间为20分钟。所述的鉴别方法，所述步骤(3)中，向步骤(2)中洗涤后的所述荧光微球与荧光标记抗人IgG按照体积比为(0.5-2):1混合。优选的，所述荧光微球与荧光标记抗人IgG按照体积比为1:1混合。所述的鉴别方法，所述步骤(3)中，所述抗人IgG的浓度为(0.5-1.5)mg/mL。优选的，所述抗人IgG的浓度为1mg/mL。所述的鉴别方法，所述步骤(1)中，取所述荧光微球与血小板特异性糖蛋白特异性单克隆抗体混合，在20-30℃下反应2-3小时，然后洗涤，将上述获得的所述荧光微球与所述血小板特异性糖蛋白混合，在35-39℃下反应0.5-1.5小时，然后洗涤，悬浮，即得所述抗原特异性荧光微球阵列。所述的鉴别方法，所述步骤(1)中，配制所述荧光微球溶液，向所述荧光微球中加入缓冲液，最终所得所述荧光微球溶液浓度为0.5％-1.5％(v/v)。优选的，所述荧光微球溶液浓度为1％(v/v)。所述的鉴别方法，所述步骤(1)中，在配制所述荧光微球溶液前，所述荧光微球采用0.5mg/mL-1.5mg/mL的乙基-(3-二甲基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC)活化。优选的，所述荧光微球采用1mg/mL的乙基-(3-二甲基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC)活化。所述的鉴别方法，所述步骤(1)中，取所述荧光微球与血小板特异性糖蛋白特异性单克隆抗体混合，所述单克隆抗体终浓度为0.2-0.3mg/mL。优选的，所述单克隆抗体终浓度为0.25mg/mL。本专利技术提供了一种用于血小板抗体特异性检测的试剂盒，包括由不同的血小板特异性糖蛋白连接在不同的荧光微球表面得到的抗原特异性荧光微球阵列。所述的试剂盒，包括如下所述抗原特异性荧光微球：以血小板特异性糖蛋白HLAⅠ类连接在荧光微球a的表面，得到抗原特异性荧光微球Y-a；以血小板特异性糖蛋白GPⅡb/Ⅲa连接在荧光微球b的表面，得到第一抗原特异性荧光微球Y-b；以血小板特异性糖蛋白GPⅠa/Ⅱa连接在荧光微球c的表面，得到第一抗原特异性荧光微球Y-c；以血小板特异性糖蛋白GPⅠb/Ⅸ连接在荧光微球d的表面，得到第一抗原特异性荧光微球Y-d；和以血小板特异性糖蛋白GPⅣ连接在荧光微球e的表面，得到第一抗原特异性荧光微球Y-e。本专利技术技术方案，具有如下优点：(1)本专利技术所述的血小板抗体特异性鉴别方法，包括如下步骤：(1)将不同的血小板特异性糖蛋白连接在不同的荧光微球表面，得到抗原特异性荧光微球，备用；(2)将所述抗原特异性荧光微球加入到待测样本中进行孵育反应，洗涤，备用；(3)向步骤(2)中加入荧光标记的抗人IgG进行孵育反应、洗涤，然后进行流式细胞检测；所述的血小板抗体特异性鉴别方法，由于将不同的血小板特异性糖蛋白连接在不同的荧光微球表面获得的抗原特异性荧光微球可以与血浆或血清中游离的血小板结合，进而可以检测血浆或血清中游离的血小板抗体，检测得到的血小板抗体结果更精确，解决了现有技术中的血小板抗体检测主要针本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种血小板抗体特异性鉴别方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将不同的血小板特异性糖蛋白连接在不同的荧光微球表面，得到抗原特异性荧光微球，备用；(2)将所述抗原特异性荧光微球加入到待测样本中进行孵育反应，洗涤，备用；(3)向步骤(2)中加入荧光标记的抗人IgG进行孵育反应、洗涤，然后进行流式细胞检测。

【技术特征摘要】
1.一种血小板抗体特异性鉴别方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将不同的血小板特异性糖蛋白连接在不同的荧光微球表面，得到抗原特异性荧光微球，备用；(2)将所述抗原特异性荧光微球加入到待测样本中进行孵育反应，洗涤，备用；(3)向步骤(2)中加入荧光标记的抗人IgG进行孵育反应、洗涤，然后进行流式细胞检测。2.根据权利要求1所述的鉴别方法，其特征在于，所述血小板特异性糖蛋白为HLAⅠ类、GPⅡb/Ⅲa、GPⅠa/Ⅱa、GPⅠb/Ⅸ和GPⅣ。3.根据权利要求2所述的鉴别方法，其特征在于，所述HLAⅠ类糖蛋白具有A2、A11、A31、A68、B7、B18、B35和B40抗原。4.根据权利要求2或3所述的鉴别方法，其特征在于，所述GPⅡb/Ⅲa糖蛋白具有HPA1a和HPA4b抗原。5.根据权利要求2-4任一项所述的鉴别方法，其特征在于，所述GPⅠa/Ⅱa糖蛋白具有HPA5a和HPA5b抗原。6.根据权利要求1-5任一项所述的鉴别方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述孵育条件为35-39℃，反应时间为15-45分钟。7.根据权利要求1-6任一项所述的鉴别方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述孵育条件为2...

【专利技术属性】
技术研发人员：段生宝，李勇，陈晔洲，蒙青林，王红梅，丁少华，魏双施，刘欢，
申请(专利权)人：中国科学院苏州生物医学工程技术研究所，
类型：发明
国别省市：江苏,32