一种快速测定磺胺类抗生素残留的仿生酶联免疫检测方法技术

本发明专利技术公开了一种快速测定磺胺类抗生素残留的仿生酶联免疫检测方法，特点是包括以下步骤：（1）将环己烷和Triton X‑100加入两口烧瓶中，磁力搅拌后依次加入量子点、正硅酸乙酯和氨水，磁力搅拌后加入模板分子溶液以及功能单体，室温下聚合反应后除去磺胺类抗生素，再分散于乙醇磷酸盐溶液中，得到分子印迹‑量子点纳米结构人工抗体溶液；（2）在每个酶标孔中依次加入分子印迹‑量子点纳米结构人工抗体溶液和样品提取液；将酶标板室温育10 min，然后用酶标仪读出发射波长在605nm下的数值，根据荧光值由标准曲线计算出样品提取液中磺胺类抗生素含量，优点是特异性强、灵敏度高、合成简单、稳定性好和检测时间短。

A biomimetic enzyme-linked immunosorbent assay for rapid determination of sulfonamide residues

The invention discloses a method for rapid determination of residues of sulfonamide antibiotics biomimetic enzyme-linked immunoassay method is characterized by comprising the following steps: (1) the Triton X cyclohexane and 100 joined the two flasks, magnetic stirring followed by adding quantum dots, TEOS and ammonia, stirring after adding template solution as well as the functional monomer, at room temperature to remove sulfonamide antibiotics after the polymerization reaction, and then dispersed in ethanol phosphate solution, by molecular imprinting quantum dot nano structure artificial antibody solution; (2) in each microplate hole are sequentially added in molecular imprinting quantum dot nano structure artificial antibody solution and sample extract; the ELISA in room temperature incubation for 10 min, and then use the microplate readout emission wavelength at 605nm, according to the fluorescence values calculated from the standard curve of sulfonamides in the extraction solution of sample containing The utility model has the advantages of high specificity, high sensitivity, simple synthesis, good stability and short detection time.

【技术实现步骤摘要】
一种快速测定磺胺类抗生素残留的仿生酶联免疫检测方法
本专利技术涉及一种磺胺类抗生素残留检测方法，尤其是涉及一种快速测定磺胺类抗生素残留的仿生酶联免疫检测方法。
技术介绍
由于养殖规模、养殖密度和养殖环境等的恶化，养殖过程中病害频发，对水产养殖业发展造成严重危害。磺胺类抗生素（Sulfonamides，SAs）是一类广谱抗菌药，主要用于预防和治疗细菌感染性疾病，或者作为饲料添加剂在动物生产中长期应用。但是，不合理使用易造成耐药性增加，在食品中残留的药物对人类健康造成潜在的危害，如诱发癌症等。因此，其在环境及食品中的残留问题引起了国内外的高度重视。因此，为保护食品安全和人类健康，必须加强对磺胺类抗生素的检测，尤其是快速检测技术。目前，磺胺类抗生素残留的检测方法主要有微生物学法、仪器分析方法和免疫法等。其中，微生物学方法虽然具有简单、费用低等特点，但是存在操作费时、敏感性和特异性都较差等问题，不能满足现在残留检测的需要。仪器分析方法主要有气相色谱（GC）、高效液相色谱（HPLC）及液质联用（LC-MS）等，这些方法具有准确、特异性好、可同时测定多种药物等优点，但是通常需要复杂、昂贵的仪器设备、操作复杂，限制了其广泛应用，且不适合现场大规模筛选检测。常规酶联免疫（Enzyme-linkedImmunosorbentAssay,ELISA）方法，具有灵敏度高、特异性高、操作简便、适用于大批量样品检测等优点，受到了高度重视，但是现有的酶联免疫主要是基于生物抗体和显色反应，其中，生物抗体具有制备繁琐、周期长、稳定性差以及显色反应灵敏度低等缺点。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种特异性强、灵敏度高、合成简单、稳定性好和检测时间短的快速测定磺胺类抗生素残留的仿生酶联免疫检测方法。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种快速测定磺胺类抗生素残留的仿生酶联免疫检测方法，包括以下步骤：（1）分子印迹-量子点纳米结构人工抗体的制备将7.5mL环己烷和1.8mLTritonX-100加入两口烧瓶中，于150rpm磁力搅拌15min，然后依次加入400μL浓度为2.5nmol/mL的量子点溶液、50μL正硅酸乙酯（TEOS）和100μL氨水，磁力搅拌2h；然后加入200μL浓度为1.0-5.0mg/mL的模板分子溶液以及20-25μL的功能单体，室温下聚合反应12h后；再加入10mL丙酮，涡旋1min，然后于9000rpm离心10min，弃掉上清液后，再加入6mL双蒸水，充分分散后，于9000rpm离心10min，最后用10.0mL由体积比为8：2的乙醇和已腈组成的混合液洗脱2h以除去磺胺类抗生素，再分散于1.0mL乙醇磷酸盐溶液中，得到分子印迹-量子点纳米结构人工抗体溶液，其中乙醇磷酸盐溶液中乙醇质量分数为50-80%；（2）待测样品检测A.用乙醇将酶标孔润洗3次，然后在每个酶标孔中依次加入50μL分子印迹-量子点纳米结构人工抗体溶液和150μL样品提取液；并设置空白对照酶标孔组，空白对照酶标孔组每孔加入150μLpH为8-10的磷酸盐缓冲液；B．将酶标板室温育10min，然后用酶标仪（Tecan,Switzerland）读出发射波长在605nm下的数值，根据荧光值由标准曲线计算出样品提取液中磺胺类抗生素含量。步骤（1）中所述的模板分子为磺胺嘧啶、磺胺甲嘧啶、磺胺-5-甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲噁唑或者磺胺二甲氧嘧啶；功能单体为氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）或者甲基丙烯酸（MAA）。步骤（1）中所述的量子点是CdS/ZnS。步骤（1）中所述的分子印迹-量子点纳米结构人工抗体的粒径为40-50nm。步骤（2）中所述的标准曲线以标准溶液浓度为横坐标，（F0/F-1）为纵坐标，其中F0为空白对照孔的平均荧光值，F为磺胺标准液或样品提取液的平均荧光值。步骤（2）中所述的样品提取液制备方法如下：准确称取待测样品2.0g，于18000rpm匀浆，然后加入2.0mL乙腈，涡旋震荡10min，超声15min，5000rpm离心5min；然后取上清液至离心管中，加入3mL乙腈饱和正己烷；手动震荡15~20s，于5000rpm离心5min，取下层液体用0.22μm滤膜过滤得到样品提取液。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：本专利技术一种快速测定磺胺类抗生素残留的仿生酶联免疫检测方法，其采用的分子印迹人工抗体（Molecularlyimprintedpolymers，MIPs）与常规生物抗体相比，具有特异性高、合成简单、稳定性好、可长期保存等优点。量子点（Quantumdots，QDs）具有较好的稳定性、宽的激发光谱和窄的发射谱、荧光寿命长等优点，因此，将量子点和分子印迹人工抗体相结合，获得对磺胺类抗生素具有特异荧光响应的分子印迹-量子点纳米结构材料（MIP-QDs），并基于酶联免疫技术原理，建立基于MIP-QDs的磺胺类抗生素仿生酶联免疫检测方法，优点如下：1）本专利技术获得的磺胺类抗生素分子印迹-量子点纳米结构人工抗体具有较高的选择性和荧光响应性能，可以代替生物抗体和显色剂应用于酶联免疫技术。同时该人工抗体由表面接枝反应制备，具有较高的稳定性和较好的荧光性能，克服了传统生物抗体制备周期长、易失活和常规显色剂灵敏度低等缺点。2）本专利技术制备的分子印迹-量子点纳米结构人工抗体，具有较好的荧光响应性能，将对分析物的特异识别和信号响应相结合，灵敏度高，同时，成本大大降低，且显著降低了分析所需时间，仅需约0.5h（常规酶联免疫时间为1-2h），适用于快速检测磺胺类抗生素残留。3）本专利技术将获得的磺胺类抗生素分子印迹-量子点纳米结构人工抗体与酶联免疫技术联用，建立对磺胺类抗生素具有高灵敏度的仿生酶联免疫检测方法。该方法对水产品中磺胺类抗生素的最低检测限为0.004μg/kg，能够满足检测需要。附图说明图1为磺胺类抗生素分子印迹-量子点纳米结构人工抗体MIP-QDs的扫描电镜图；图2为磺胺类抗生素分子印迹-量子点纳米结构人工抗体MIP-QDs的透射电镜图；图3为MIP-QDs和NIP-QDs对SDZ及其类似物SM、SMZ、SMX、SDM、SME特异性，其中NIP-QDs为不加模板的空白对照分子印迹-量子点纳米结构人工个抗体；图4为磺胺类抗生素ELISA标准曲线。具体实施方式以下结合附图实施例对本专利技术作进一步详细描述。一、具体实施例本专利技术是将磺胺类抗生素分子印迹-量子点纳米结构人工抗体作为仿生抗体和信号响应物质，基于酶联免疫技术原理，建立对磺胺类抗生素具有高灵敏度度和选择性的快速检测方法，具体过程如下：1、分子印迹-量子点纳米结构人工抗体的制备将7.5mL环己烷和1.8mLTritonX-100加入两口烧瓶中，150rpm磁力搅拌15min，然后依次加入400μL浓度为2.5nmol/mL的量子点溶液（量子点是CdS/ZnS）、50μL正硅酸乙酯（TEOS）和100μL氨水，磁力搅拌2h；然后加入200μL浓度为1.0-5.0mg/mL的模板分子溶液以及20-25μL的功能单体，室温下聚合反应12h后；再加入10mL丙酮，涡旋1min，然后于9000rpm离心10min，弃掉上清液后，再加入6mL双蒸水，充分分散后，于9000rpm离心10本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速测定磺胺类抗生素残留的仿生酶联免疫检测方法，其特征在于包括以下步骤：（1）分子印迹‑量子点纳米结构人工抗体的制备将7.5 mL环己烷和1.8 mL Triton X‑100加入两口烧瓶中，于150 rpm磁力搅拌15 min，然后依次加入400 μL浓度为2.5 nmol/mL的量子点溶液、50 μL正硅酸乙酯和100 μL氨水，磁力搅拌2 h；然后加入200 μL 浓度为1.0‑5.0 mg/mL的模板分子溶液以及20‑25 μL的功能单体，室温下聚合反应12 h后；再加入10 mL丙酮，涡旋1 min，然后于9000 rpm离心10 min，弃掉上清液后，再加入6 mL双蒸水，充分分散后，于9000 rpm离心10 min，最后用10.0 mL由体积比为8：2 的乙醇和已腈组成的混合液洗脱2 h以除去磺胺类抗生素，再分散于1.0 mL乙醇磷酸盐溶液中，得到分子印迹‑量子点纳米结构人工抗体溶液，其中乙醇磷酸盐溶液中乙醇质量分数为50‑80%；（2）待测样品检测A.用乙醇将酶标孔润洗3次，然后在每个酶标孔中依次加入50 μL 分子印迹‑量子点纳米结构人工抗体溶液和150 μL样品提取液；并设置空白对照酶标孔组，空白对照酶标孔组每孔加入150μL pH为8‑10的磷酸盐缓冲液；B．将酶标板室温育10 min，然后用酶标仪读出发射波长在605nm下的数值，根据荧光值由标准曲线计算出样品提取液中磺胺类抗生素含量。...

【技术特征摘要】
1.一种快速测定磺胺类抗生素残留的仿生酶联免疫检测方法，其特征在于包括以下步骤：（1）分子印迹-量子点纳米结构人工抗体的制备将7.5mL环己烷和1.8mLTritonX-100加入两口烧瓶中，于150rpm磁力搅拌15min，然后依次加入400μL浓度为2.5nmol/mL的量子点溶液、50μL正硅酸乙酯和100μL氨水，磁力搅拌2h；然后加入200μL浓度为1.0-5.0mg/mL的模板分子溶液以及20-25μL的功能单体，室温下聚合反应12h后；再加入10mL丙酮，涡旋1min，然后于9000rpm离心10min，弃掉上清液后，再加入6mL双蒸水，充分分散后，于9000rpm离心10min，最后用10.0mL由体积比为8：2的乙醇和已腈组成的混合液洗脱2h以除去磺胺类抗生素，再分散于1.0mL乙醇磷酸盐溶液中，得到分子印迹-量子点纳米结构人工抗体溶液，其中乙醇磷酸盐溶液中乙醇质量分数为50-80%；（2）待测样品检测A.用乙醇将酶标孔润洗3次，然后在每个酶标孔中依次加入50μL分子印迹-量子点纳米结构人工抗体溶液和150μL样品提取液；并设置空白对照酶标孔组，空白对照酶标孔组每孔加入150μLpH为8-10的磷酸盐缓冲液；B．将酶标板室温育10min，然后用酶标仪读出发射波长在605nm下的数值，根据荧光值由标准曲...

【专利技术属性】
技术研发人员：史西志，丁浩，孙爱丽，李德祥，陈炯，
申请(专利权)人：宁波大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33