一种时间分辨荧光定量检测尿微量白蛋白的试剂盒及方法技术

本发明专利技术涉及一种时间分辨荧光定量检测尿微量白蛋白的试剂盒及检测方法。所述试剂盒包括时间分辨荧光试纸卡、样本稀释液和含有定标曲线的SD卡，所述时间分辨荧光试纸卡包括检测试纸条，所述试纸条由底衬以及粘贴在底衬上的样品垫、硝酸纤维素膜和吸水纸组成，所述硝酸纤维素膜上依次设置有微球线、检测线和质控线，所述微球线由标记有人白蛋白单克隆抗体的时间分辨荧光微球组成，检测线包被有人白蛋白重组抗原，质控线包被有羊抗鼠IgG。本发明专利技术试剂盒能够准确定量检测人尿液中微量白蛋白的含量，标记通过共价键将微球与抗体连接，标记产物稳定。具有检测范围宽(2～300mg/ml)、灵敏度高(检出限2mg/ml)、准确度高、检测快速简便等特点。

Reagent kit and method for quantitative detection of urinary microalbumin by time resolved fluorescence

The present invention relates to a kit for detecting urine albumin by time resolved fluorescence quantitative detection and a detection method thereof. The kit includes a time-resolved fluorescence test card, sample dilution and contain the calibration curve of SD card, the time resolved fluorescence test card includes a test strip, the strip comprises a bottom lining and pasted on the bottom lining on the sample pad, nitrocellulose membrane and absorbent paper, the cellulose nitrate film the microspheres are orderly arranged on line detection line and a quality control line, the line is marked by human albumin microspheres monoclonal antibody time-resolved fluorescent microspheres. The detection line is coated with recombinant human albumin, control line coated with Goat anti mouse IgG. The reagent kit of the invention can accurately and quantitatively detect the content of micro albumin in human urine, and label the microsphere to connect with the antibody through the covalent bond, and the product is stable. The utility model has the advantages of wide detection range (2 to 300mg/ml), high sensitivity (detection limit 2mg/ml), high accuracy, fast and simple detection, etc..

【技术实现步骤摘要】
一种时间分辨荧光定量检测尿微量白蛋白的试剂盒及方法(一)
本专利技术涉及一种时间分辨荧光定量检测尿微量白蛋白的试剂盒及检测方法。(二)
技术介绍
尿微量白蛋白是指在尿液中出现微量白蛋白。白蛋白是一种血液中正常蛋白质，人体代谢正常情况下，尿液中白蛋白极少，每升尿液白蛋白不超过20mg(<20mg/L)，所以叫微量白蛋白。但糖尿病肾病、高血压肾病等早期肾脏受损和心血管疾病并发症等发生时会造成肾脏固有细胞损伤，使肾脏固有细胞结构及功能发生变化而导致白蛋白含量在尿液中升高。尿液中微量白蛋白在20～200mg/L范围内，就属于微量白蛋白尿，当尿液中微量白蛋白超过200mg/L时，证明患者有大量白蛋白漏出，可能出现低蛋白血症，可发展为肾病，若不及时治疗会进入尿毒症期。尿微量白蛋白见于糖尿病肾病、高血压、妊娠子痫前期，是肾损伤的早期敏感指标。现有技术中测定尿微量白蛋白的方法主要有免疫比浊法、荧光免疫层析法、酶联免疫法、化学发光法、胶体金法等。其中胶体金法具有操作简单快速的优点，但灵敏度低且定量不准确；酶联免疫法灵敏度高，样品量大可定量检测，但操作时间长且自动化低；免疫比浊法和化学发光法较为敏感、准确，可应用于全自动生化仪，但需要仪器且耗时较长，适合处理大量样本，无法满足快速检测的目的；免疫荧光法是将尿微量白蛋白抗体共价结合于荧光微球表面活性基团上，通过激发后检测线是否产生荧光来判断结果，快速便捷可准确定量同时具有高灵敏度、标记物稳定等优点，在医学免疫检测领域广泛应用。然而在生物流体和血清中的许多复合物和蛋白本身就可以发荧光，因此使用传统的荧光素等发色团进行荧光检测时灵敏度就会严重下降，但大部分背景荧光信号是短时存在的，可利用稀土荧光微球(镧系元素螯合物)作为标记物来标记抗体或抗原。因镧系元素螯合物stoke位移大很容易分辨激发光和发射光，从而排除激发光干扰，且衰变时间长可通过时间分辨消除本底荧光干扰，另外镧系元素螯合物激发光谱宽而发射光谱窄可进一步提高灵敏度和降低本底荧光。因此采用时间分辨荧光免疫技术，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是针对现有技术的不足和缺陷提供一种利用时间分辨荧光免疫层析技术的灵敏性，结合干式免疫荧光分析仪实现高灵敏度、可准确定量、简便快捷的时间分辨荧光定量检测尿微量白蛋白的试剂盒及检测方法。本专利技术采用的技术方案是：一种时间分辨荧光定量检测尿微量白蛋白的试剂盒，包括时间分辨荧光试纸卡、样本稀释液和含有定标曲线的SD卡；所述时间分辨荧光试纸卡包括检测试纸条，所述试纸条由底衬以及粘贴在底衬上的样品垫、硝酸纤维素膜和吸水纸组成，所述样品垫、硝酸纤维素膜和吸水纸顺次搭接粘贴在底衬上；所述硝酸纤维素膜上依次设置有微球线、检测线和质控线，微球线、检测线和质控线相互平行，间隔距离为3～5mm，其中微球线靠近加样孔，质控线远离加样孔，所述微球线由标记有人白蛋白单克隆抗体的时间分辨荧光微球组成，检测线包被有人白蛋白重组抗原，质控线包被有羊抗鼠IgG抗体。所述时间分辨荧光微球掺杂有固含量1％(w/w)的稀土铕元素，且微球粒径为100nm～300nm，在基态下稳定，在350～380nm的激发光源作用下发射出波长范围在600～620nm的荧光。微球线中人白蛋白单克隆抗体的含量为50～200μg抗体/200μl荧光微球，检测线中人白蛋白重组抗原包被浓度为0.5～2mg/ml、用量为0.5～1.5μl包被液量/cm膜，质控线中羊抗鼠IgG抗体包被浓度为0.5～2mg/ml、用量为0.5～1.5μl包被液量/cm膜。所述检测试纸条由如下方法制备：(1)时间分辨荧光微球的活化超声波处理荧光微球2min后，取200μl荧光微球以14000rpm高速离心5～15min后，沉淀物用10～100mM，pH为5.0～7.0的MES溶液洗涤至1ml，超声波处理2min；加入10～100μl的20～100mg/ml碳二亚胺，混匀5～10min，再加入50～200μl的20～100mg/mlN-羟基硫代琥珀酰亚胺，混匀10～20min后14000rpm高速离心5～15min，沉淀用pH为5.0～7.0的MES溶液洗涤至1ml；(2)时间分辨荧光微球标记人白蛋白单克隆抗体的制备在上述活化后的荧光微球超声波处理2min后按照50～200μg/200μl加入人白蛋白单克隆抗体，混匀1～3小时，用含0.5％BSA的10～50mM、pH7.5～8.5Tris-HCl封闭液封闭0.5～1小时后14000rpm高速离心5～15min，用含1％Nacl、0.5％BSA、0.1％Tween20的10～50mM、pH7.5～8.5Tris-Hcl保存液洗涤并重悬至200μl于4℃避光保存。(3)包被膜的制备分别用包被缓冲液(含2.5％蔗糖的10mMPBS缓冲液)将人白蛋白重组抗原和羊抗鼠IgG抗体调整浓度到0.5～2mg/ml，用量为0.5～1.5μl包被液量/cm膜，分别作为检测线和质控线平行划于硝酸纤维素膜上进行包被，用微球稀释液将标记人白蛋白单克隆抗体的时间分辨荧光微球3～6倍稀释，用量为0.5～1.5μl包被液量/cm膜，作为微球线划于硝酸纤维素膜上靠近样品垫方向进行包被，质控线、检测线和微球线间隔3～7mm，置于烘箱中，45℃烘干过夜。(4)在底衬上顺次相互搭接地粘贴样品垫、包被膜和吸水纸得到试纸板，切割得到所述试纸条。所述时间分辨荧光试纸卡由检测试纸条固定在塑料底卡上，试纸表面用卡面压紧，且卡面在对应样品垫和硝酸纤维素膜的部分分别预留加样孔和观察窗。所述样本稀释液组成如下：NaCl0.5％，BSA0.5％，Tween1％，溶剂为10～50mM、pH7.5～8.5Tris-HCl缓冲液，以270μl/管分装于离心管中。样本缓冲液用于层析样品。所述含有标准曲线的SD卡，是通过时间分辨荧光试纸条测定不同浓度的校准品，以校准品浓度为横坐标，以荧光信号比值作为纵坐标，绘制成标准曲线，写入并生成相应二维码信息存储在SD卡中获得。通过干式荧光免疫分析仪可读取试剂卡上对应的二维码信息并测得相应浓度。本专利技术还涉及利用所述试剂盒的定量检测尿微量白蛋白的方法，所述方法包括：(1)将检测试剂盒和样品置于室温下，待恢复至室温后使用；(2)开启干式荧光免疫分析仪，预热5min后插入对应SD卡；(3)精确吸取30μL待测尿液加入样本稀释液中，混匀；(4)吸取混合后样本80μL，加入到检测卡加样孔中；(5)将检测卡插入检测槽，10min后检测并读取和打印检测结果。检测范围2～300mg/L。本专利技术所述时间分辨荧光定量检测尿微量白蛋白的试剂盒的检测原理是竞争法，检测人尿液中微量白蛋白的含量。含尿微量白蛋白的尿液样本稀释液滴加在样本加样区，通过毛细作用层析至硝酸纤维素膜微球线，与时间分辨荧光微球标记的人白蛋白单克隆抗体结合，形成微球抗体-抗原复合物，层析至检测区，因检测线固定的人白蛋白重组抗原和样本中微量白蛋白与微球标记的人白蛋白单克隆抗体竞争结合，因此样本中白蛋白越多，检测线处结合的微球抗体越少，而多余的荧光微球标记物继续向前层析，与固定在质控线羊抗鼠结合。反应结束后，用紫外光源本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种时间分辨荧光定量检测尿微量白蛋白的试剂盒，包括时间分辨荧光试纸卡、样本稀释液和含有定标曲线的SD卡，其特征在于：所述时间分辨荧光试纸卡包括检测试纸条，所述检测试纸条由底衬以及粘贴在底衬上的样品垫、硝酸纤维素膜和吸水纸组成，所述样品垫、硝酸纤维素膜和吸水纸顺次搭接粘贴在底衬上；所述硝酸纤维素膜上依次设置有微球线、检测线和质控线，微球线、检测线和质控线相互平行，间隔距离为3～5mm，其中微球线靠近加样孔，质控线远离加样孔；所述微球线由标记有人白蛋白单克隆抗体的时间分辨荧光微球组成；所述时间分辨荧光微球掺杂有固含量1％的稀土铕元素，粒径为100nm～300nm；人白蛋白单克隆抗体的含量为50～200μg抗体/200μl荧光微球；所述检测线包被有人白蛋白重组抗原，质控线包被有羊抗鼠IgG抗体；人白蛋白重组抗原包被浓度为0.5～2mg/ml、用量为0.5～1.5μl包被液量/cm膜，羊抗鼠IgG抗体包被浓度为0.5～2mg/ml、用量为0.5～1.5μl包被液量/cm膜。

【技术特征摘要】
1.一种时间分辨荧光定量检测尿微量白蛋白的试剂盒，包括时间分辨荧光试纸卡、样本稀释液和含有定标曲线的SD卡，其特征在于：所述时间分辨荧光试纸卡包括检测试纸条，所述检测试纸条由底衬以及粘贴在底衬上的样品垫、硝酸纤维素膜和吸水纸组成，所述样品垫、硝酸纤维素膜和吸水纸顺次搭接粘贴在底衬上；所述硝酸纤维素膜上依次设置有微球线、检测线和质控线，微球线、检测线和质控线相互平行，间隔距离为3～5mm，其中微球线靠近加样孔，质控线远离加样孔；所述微球线由标记有人白蛋白单克隆抗体的时间分辨荧光微球组成；所述时间分辨荧光微球掺杂有固含量1％的稀土铕元素，粒径为100nm～300nm；人白蛋白单克隆抗体的含量为50～200μg抗体/200μl荧光微球；所述检测线包被有人白蛋白重组抗原，质控线包被有羊抗鼠IgG抗体；人白蛋白重组抗原包被浓度为0.5～2mg/ml、用量为0.5～1.5μl包被液量/cm膜，羊抗鼠IgG抗体包被浓度为0.5～2mg/ml、用量为0.5～1.5μl包被液量/cm膜。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述检测试纸条由如下方法制备：(1)时间分辨荧光微球的活化超声波处理荧光微球2min后，取200μl荧光微球以14000rpm高速离心5～15min后，沉淀物用10～100mM，pH为5.0～7.0的MES溶液洗涤至1ml，超声波处理2min；加入10～100μl的20～100mg/ml碳二亚胺，混匀5～10min，再加入50～200μl的20～100mg/mlN-羟基硫代琥珀酰亚胺，混匀10～20min后14000rpm高速离心5～15min，沉淀用pH为5.0～7.0的MES溶液洗涤至1ml；(2)时间分辨荧光微球标记人白蛋白单克隆抗体的制备在上述活化后的荧光微球超声波处理2min后按照50～200μg/200μl加入人白蛋白单克隆抗体，混匀1～3小时，用含0.5％BSA的10～50mM、pH7.5～8.5Tris-Hcl封闭液封闭0.5～1小时后...

【专利技术属性】
技术研发人员：张云，张肖，杨福太，
申请(专利权)人：厦门奥德生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：福建,35