跨越式滚环核酸等温扩增目的DNA的引物对、试剂盒及其扩增方法技术

本发明专利技术公开了一种跨越式滚环核酸等温扩增目的DNA的引物对及含有该引物对的试剂盒，该引物对设计合理，特异性强，应用于跨越式滚环核酸等温扩增时，能实现引物自身不扩增而目的基因扩增的效果；本发明专利技术还提供了跨越式滚环核酸等温扩增目的DNA的扩增方法，它包括提取模板、扩增、检测步骤，在扩增过程中实现目的DNA扩增而引物自身不扩增的结果，该方法简单，过程易于控制，步骤简单，耗时短，成本低。本发明专利技术适用于对目的DNA进行扩增。

【技术实现步骤摘要】
跨越式滚环核酸等温扩增目的DNA的引物对、试剂盒及其扩增方法
本专利技术属于生物
，涉及一种引物对及利用该引物对进行扩增目的DNA的方法，具体地说是一种跨越式滚环核酸等温扩增目的DNA的引物对及其方法。
技术介绍
核酸体外扩增是分子生物学检测技术的基础，也是生物学分析的重要方法，通过核酸扩增可以扩增和分离目的基因，从而应用于在临床医疗诊断、分子诊断、食品安全检测及环境安全监测等领域。随着分子生物学的发展，新的核酸扩增技术不断涌现。常见的核酸扩增技术有聚合酶链式反应（PCR）、环介导等温扩增（LAMP）以及滚环等温扩增（RCA）方法，这些方法都在微生物检测领域有广泛的应用，有成功的实践经验，是现今为止较为成熟的检测方法。但是每一种技术都有自身缺陷。PCR方法作为最原始的体外核酸扩增技术，发展时间最长，也最为稳定。该方法首先需要一对引物引发扩增反应，然后经过“变性—退火（复性）—延伸”三个步骤不断的重复实现产物积累。PCR反应的基本原理为：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至90-95℃一定时间后，使DNA双链解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至50-60℃，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在DNA聚合酶的作用下，于70-75℃，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。由此可见，在PCR实施过程中需要不断进行变温循环，这使得PCR的实施需要依赖于温度循环仪。该仪器现今为止价格依然昂贵，对于一些中小型企业，或是基层的检测机构而言，无疑增加了负担，对该方法的推广也增加了难度。LAMP方法是由日本人Notomi在2000年专利技术的，其特点是针对靶基因的6个区域设计4条特异性引物（上游内引物FIP、下游内引物BIP、上游外引物F3及下游外引物B3），在链置换DNA聚合酶(BstDNApolymerase)的作用下，60-65℃恒温扩增，60分钟左右即可实现109-1010倍的核酸扩增，具有操作简单、灵敏度高等特点。但其引物设计复杂，而且在LAMP的操作过程中，假阳性问题十分凸显。根据报道，引起LAMP假阳性的主要有两个原因，一是由于多条引物之间的相互作用，二是由于受到气溶胶的影响。但这些问题在LAMP操作中难以真正得到解决：首先，引物之间的相互作用，由于LAMP本身需要4条引物，有时为了加快反应速率，可能会使用多达6条引物，所以引物之间的发生相互作用的几率也就更大。这也为LAMP的引物设计过程也增加的更大的难度。为找到合适的引物，需要对很多套引物分别进行试验，从中挑选适宜的引物，该过程费时费力且增加成本。另外，实验室的客观条件决定了LAMP操作过程中受到气溶胶影响的可能性，想要免除气溶胶的影响，实验室需要有良好的条件，且操作人员需要有较高的素质。这些都在一定程度上限制了LAMP的推广。RCA方法起始于1998年，该技术模拟自然界微生物环状DNA的滚环复制过程，同样在具有链置换活性的DNA聚合酶（BstDNApolymerase）作用下由一条引物即可引发沿环形DNA模板的链置换合成，实现环状DNA模板的体外等温扩增。针对于环状DNA，RCA方法展现了较好的优越性，但是对于更常见的线性DNA而言，RCA则需要首先进行一个独立步骤，获得环化的DNA。该过程依赖于锁式探针，获得含有一定长度的目的序列的环状DNA。包括探针设计以及使用探针生成环状DNA的过程，使得RCA反应需要消耗更长的时间，进行更复杂的步骤，花费更高的成本。因此现今为止，RCA方法在基层检测中并没有得到广泛应用。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题，是提供一种跨越式滚环核酸等温扩增目的DNA的引物对及含有该引物对的试剂盒，该引物对设计合理，特异性强，应用于跨越式滚环核酸等温扩增时，能实现引物自身不扩增而目的基因扩增的效果。本专利技术的另外一个目的是，提供了跨越式滚环核酸等温扩增目的DNA的扩增方法，该方法简单，过程易于控制，步骤简单，成本低。为解决上述技术问题，本专利技术所采取的技术方案是：一种跨越式滚环核酸等温扩增目的DNA的引物对，包括上游引物和下游引物，所述上游引物和下游引物之间的连续互补碱基小于或等于4对，所述上游引物和下游引物3’端和5’端的4个碱基中任意两个碱基不互补，所述上游引物和下游引物，至少有一条引物不具有二级结构，引物的GC含量为45-55%，Tm值为55-58℃。一种跨越式滚环核酸等温扩增目的DNA的试剂盒，即含有所述引物对的试剂盒。本专利技术还提供了一种跨越式滚环核酸等温扩增目的DNA的扩增方法，它按照如下的步骤顺序依次进行：（1）从样品中提取DNA为模板；（2）利用上述的引物对或者上述的试剂盒中引物对作为扩增的引物，进行SRCA扩增，得到扩增产物；（3）检测扩增产物，做出判断。作为上述扩增方法的限定，所述SRCA的反应体系如下：上游引物1μL；下游引物1μL；dNTPs2.5mmol/Leach5μL；MgSO420mmol/L1μL；10×reactionbuffer3μL；BstDNA聚合酶8U/μL1μL；模板DNA1μL；二甲基亚砜0.2μL；ddH2O6.8μL作为上述扩增方法的进一步限定，所述SRCA扩增包括三个阶段：预变性阶段：将权利要求4所述体系中除BstDNA聚合酶外的其它物质加入离心管中，于94℃下加热3min，然后立即取出离心管，冰浴2min，冰浴结束后混匀离心管中液体；扩增阶段：向上述离心管中加入BstDNA聚合酶，将离心管置于孵育器中，于60-65℃下，反应90min；终止阶段：将孵育器温度升高至80℃并加热5min，使酶失活，终止反应。由于采用了上述的技术方案，本专利技术与现有技术相比，所取得的技术进步在于：1.费用低：与PCR技术相比，本专利技术提供的扩增方法，在60-65℃的温度下就可以完成扩增过程，因此不需要价格较高的精密仪器-温度循环仪，只需要恒温水浴锅即可；2.特异性强：引物对的特异性强，可以特异性的识别目标序列，对于非目标序列不发生扩增反应，避免了引物自身扩增，使其能够应用于分子生物学检测领域；3.快速高效、方法简便：本专利技术所提供的扩增方法于恒温下进行扩增反应，整个扩增反应在1.5h内即可完成，与RCA相比，SRCA反应扩增线性DNA不需要环化和连接酶连接，因此SRCA方法更加简便、省时。；4.稳定性好：与LAMP方法相比较，SRCA方法更少受到气溶胶的影响，且只需要一对引物，引物之间发生相互结合的可能性更小，因此假阳性现象不明显；5.结果易判定：SRCA方法可以通过肉眼可直接观测反应结果，在不具备电泳设备的实验室，可以通过添加荧光染料或是离心观察沉淀对反应结果进行判定，更适合现场快速检测，更适应基层单位应用。本专利技术适用于对目的DNA进行扩增。本专利技术下面将结合具体实施例作进一步详细说明。附图说明图1为实施例7中琼脂糖本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种跨越式滚环核酸等温扩增目的DNA的引物对，包括上游引物和下游引物，其特征在于：所述上游引物和下游引物之间的连续互补碱基小于或等于4对，所述上游引物和下游引物3’端和5’端的4个碱基中任意两个碱基不互补，所述上游引物和下游引物，至少有一条引物不具有二级结构，引物的GC含量为45‑55%，Tm值为55‑58℃。

【技术特征摘要】
1.一种跨越式滚环核酸等温扩增目的DNA的引物对，包括上游引物和下游引物，其特征在于：所述上游引物和下游引物之间的连续互补碱基小于或等于4对，所述上游引物和下游引物3’端和5’端的4个碱基中任意两个碱基不互补，所述上游引物和下游引物，至少有一条引物不具有二级结构，引物的GC含量为45-55%，Tm值为55-58℃。2.一种跨越式滚环核酸等温扩增目的DNA的试剂盒，其特征在于：含有权利要求1所述引物对的试剂盒。3.一种跨越式滚环核酸等温扩增目的DNA的扩增方法，其特征在于它按照如下的步骤顺序依次进行：（1）从样品中提取DNA为模板；（2）利用权利要求1的引物对或者权利要求2的试剂盒中引物对作为扩增的引物，进行SRCA扩增，得到扩增产物；（3）检测扩增产物，做出判断。4.根据权利要求3所述的跨越式滚环核酸等温扩增目的DNA的扩增方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：张伟，马晓燕，檀建新，张先舟，杨倩，袁耀武，李英军，王志岩，张蕴哲，
申请(专利权)人：河北农业大学，
类型：发明
国别省市：河北,13