一种原料乳中抗生素残留的快速检测方法技术

本发明专利技术公开了一种原料乳中抗生素残留的快速检测方法，属于生物技术领域。本发明专利技术将冷冻干燥保存的嗜热脂肪地芽胞杆菌加入到营养肉汁琼脂培养基中进行活化培养，将活化后的嗜热脂肪地芽胞杆菌接种到磷酸盐缓冲液中获得悬浮液；在溴甲酚紫蛋白胨培养基中加入嗜热脂肪地芽胞悬浮液，获得测试培养基；将测试培养基与待检测原料乳按照体积比为1:2‑1:3混合均匀，在75℃‑80℃下水浴培养2.0h‑2.2h，观察培养基颜色的变化。本发明专利技术通过将水浴培养温度调整为75℃，并且配合相应合理的测试培养基与原料乳的体积比进而大大缩短了体系变色反应时间，将时间缩短了近20％左右，进一步提高了检测效率。

【技术实现步骤摘要】
一种原料乳中抗生素残留的快速检测方法
本专利技术涉及一种原料乳中抗生素残留的快速检测方法，属于生物

技术介绍
原料乳中抗生素是指动物产品的任何可食部分所含兽药的母体化合物及其代谢物，及与兽药有关的杂质。泌乳动物在饲养过程中由于不合理使用治疗药物，导致其乳中广泛存在原料乳中抗生素残留。目前，原料乳中抗生素残留仍然是全球控制牛奶安全最为重要的问题之一，尤其是对中国来说，奶牛疾病的发生率高，奶牛专用药剂比较少，奶牛用药较混乱，致使有些疾病治疗的效果不理想，原料奶药检超标时有出现。虽然中国在兽药残留标准体系建设和兽药残留方法检测方面已经取得了长足的进步，但与相关国际组织和发达国家相比，与近年来发生的重大乳品安全事件所引起的民众恐慌相比，中国的牛奶中兽药残留体系建设还不完善，还需要进一步健全。快速检测方法首先是能缩短检测时间，以及在样品制备、实验准备、操作过程简化和自动化上简化方法。无论在重大社会活动中，还是在日常卫生监督过程中，除感官检测外，针对常见引发急性中毒的有毒物质或重要控制环节开展现场快速检测，对某些慢性伤害物质可能大量超标以及劣质食品的快速检测，对餐饮具、食物加工器具表面洁净度的快速检测，对化学消毒剂有效成分的快速检测等，能在现场及时发现可疑问题，迅速采取相应措施，这对提高监督工作效率和力度，保障卫生安全有着重要的意义。根据《GB/T4789.27-2008鲜乳中抗生素残留检验》第二方法嗜热脂肪地芽胞杆菌抑制法中，但是此种方法检测时间较长，不利于现场的快速检测，不利于提高检测效率。
技术实现思路
为解决现有技术检测时间长、检测效率低的问题，本专利技术提供了一种原料乳中抗生素残留的检测方法，采用的技术方案如下：本专利技术的目的在于提供一种原料乳中抗生素残留的检测方法，该方法包括如下步骤：1)将冷冻干燥保存的嗜热脂肪地芽胞杆菌加入到营养肉汁琼脂培养基中进行活化培养，将活化后的嗜热脂肪地芽胞杆菌接种到磷酸盐缓冲液中，并进行计数，使其浓度约为1×108CFU/mL，获得嗜热脂肪地芽胞悬浮液；2)在溴甲酚紫蛋白胨培养基中加入嗜热脂肪地芽胞悬浮液，混合均匀后进行计数，使芽孢的终浓度约为1×106CFU/mL-2×106CFU/mL，获得嗜热脂肪地芽胞杆菌测试培养基，备用；3)将测试培养基与待检测原料乳按照体积比为2:1-3:1混合均匀，同时设置阳性对照和阴性对照，阳性对照为与待检测原料乳的体积相同的抗生素标准参照溶液，阴性对照为与待检测原料乳的体积相同的无抗生素的脱脂乳，在75℃-80℃下水浴培养2.0h-2.2h，观察培养基颜色的变化，如果颜色没有变化，须再于水浴中培养30min作最终观察。优选地，步骤1)所述营养肉汁琼脂培养基包含蛋白胨5.0g，牛肉浸取物3.0g，NaCl5.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1.0L，pH7.0。优选地，步骤1)所述活化培养的温度为55℃。优选地，步骤1)所述活化培养过程中加入5mgMnSO4·H2O。优选地，步骤3)所述水浴培养的温度为75℃。更优选地，本专利技术的测试体积(测试培养基和待检测原料乳的总体积)为600μL。更优选地，本专利技术所述的方法，包括如下步骤：1)将冷冻干燥保存的嗜热脂肪地芽胞杆菌加入到营养肉汁琼脂培养基中进行活化培养，将活化后的嗜热脂肪地芽胞杆菌接种到磷酸盐缓冲液中，并进行计数，使其浓度约为1×108CFU/mL，获得嗜热脂肪地芽胞悬浮液；2)在溴甲酚紫蛋白胨培养基中加入嗜热脂肪地芽胞悬浮液，混合均匀后进行计数，使芽孢的终浓度约为1×106CFU/mL-2×106CFU/mL，获得嗜热脂肪地芽胞杆菌测试培养基，备用；3)将测试培养基与待检测原料乳按照体积比为2:1混合均匀，同时设置阳性对照和阴性对照，阳性对照为与待检测原料乳的体积相同的抗生素标准参照溶液，阴性对照为与待检测原料乳的体积相同的无抗生素的脱脂乳，在75℃下水浴培养2.0h-2.2h，观察培养基颜色的变化，如果颜色没有变化，须再于水浴中培养30min作最终观察。本专利技术有益效果：本专利技术通过优化国标方法，将水浴培养的温度从65℃调整为75℃，发现在75℃下，产生了意料不到的技术效果，获得了较短的体系变色反应时间，能够大大缩短检测时间，将2.5±0.2h缩短至2.2h±0.2h，将时间缩短了近12％左右，最短可以将时间缩短至2.0h，将时间缩短了近20％，进一步提高了检测效率，并能满足原料乳中抗生素检测要求，本专利技术通过调整水浴时间并且配合相应合理的测试培养基与原料乳的体积比进而缩短了体系变色反应时间，取得了意料不到的技术效果。附图说明图1为水浴温度对体系变色时间的影响。图2为测试培养基与原料乳的体积比对体系变色时间的影响。图3为两因素交互作用对时间的影响。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术做进一步说明，但本专利技术不受实施例的限制。实施例1：1实验2.1材料2.1.1菌种选择嗜热脂肪地芽胞杆菌(Geobacillusstearothermophilus)：根据《GB/T4789.27-2008鲜乳中抗生素残留检验》采用的阳性对照菌株，用于牛奶中青霉素及其他抑制剂的检测。2.1.2试剂及材料营养肉汤、营养琼脂、蛋白胨、琼脂粉，生化试剂，溴甲酚紫，化学纯，青霉素钠，红霉素，头孢氨苄，四环素，土霉素，阿莫西林，头孢噻呋，磷酸二氢钠，磷酸二氢钾，氯化钠，氢氧化钠。2.2仪器和设备洁净工作台，全自动高压灭菌器，电热恒温培养箱，特勒台式PH计，电热数字显示恒温水浴锅，涡旋混合器，微量进样器。2.3培养方法2.3.1嗜热脂肪地芽胞杆菌活化培养将冷冻干燥保存的嗜热脂肪地芽胞杆菌加入到营养肉汁琼脂中。培养基成分如下：蛋白胨5.0g，牛肉浸取物3.0g，NaCl5.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1.0L，pH7.0。在培养芽孢杆菌时加入5mg的MnSO4·H2O，有利于产生芽孢。培养温度55℃。需氧类型为好氧。2.3.2嗜热脂肪地芽孢杆菌芽孢悬浮液制备将活化斜面菌种接种到磷酸盐缓冲液中，75℃加热10min，置于营养琼脂培养18～20h，用生理盐水洗下菌苔,将菌液移种于盛有250mL芽孢培养基的克氏瓶内，55℃培养4d，用10mL生理盐水洗下菌苔,并进行充分混合。以转速4000r/min离心15min,弃去上清液。悬浮液以转速8000r/min离心15min。并与80℃水浴10min，备用。并进行计数，使其浓度约为1×108CFU/mL，获得嗜热脂肪地芽胞悬浮液。2.3.3嗜热脂肪地芽胞杆菌菌落总数的测定取洁净的血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。然后在显微镜下找到计数室。将嗜热脂肪地芽胞杆菌悬浮液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘摘入一小滴，让菌悬液利用液体的表面张力充满计数区，勿使气泡产生，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液。静置片刻，先在低倍镜下找到计数区后，再转换高倍镜观察并计数。2.3.4嗜热脂肪地芽胞杆菌测试培养基的制备在溴甲酚紫蛋白胨培养基中加入嗜热脂肪地芽胞悬浮液，并进行计数，使其浓度约为1×108CFU/mL，获得嗜热脂肪地芽胞悬浮液,然后加入到EP管中备用。2.3原料乳中抗生素检测的影响条件优化根据国标第二方法中，测试培养基与原料乳的体积比(溴甲酚紫蛋白胨培本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种原料乳中抗生素残留的快速检测方法，其特征在于，包括如下步骤：1)将冷冻干燥保存的嗜热脂肪地芽胞杆菌加入到营养肉汁琼脂培养基中进行活化培养，将活化后的嗜热脂肪地芽胞杆菌接种到磷酸盐缓冲液中，并进行计数，使其浓度约为1×10

【技术特征摘要】
1.一种原料乳中抗生素残留的快速检测方法，其特征在于，包括如下步骤：1)将冷冻干燥保存的嗜热脂肪地芽胞杆菌加入到营养肉汁琼脂培养基中进行活化培养，将活化后的嗜热脂肪地芽胞杆菌接种到磷酸盐缓冲液中，并进行计数，使其浓度约为1×108CFU/mL，获得嗜热脂肪地芽胞悬浮液；2)在溴甲酚紫蛋白胨培养基中加入嗜热脂肪地芽胞悬浮液，混合均匀后进行计数，使芽孢的终浓度约为1×106CFU/mL-2×106CFU/mL，获得嗜热脂肪地芽胞杆菌测试培养基，备用；3)将测试培养基与待检测原料乳按照体积比为2:1-3:1混合均匀，同时设置阳性对照和阴性对照，阳性对照为与待检测原料乳的体积相同的抗生素标准参照溶液，阴性对照为与待检测原料乳的体积相同的无抗生素的脱脂乳...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖莲荣，张青燕，任皓威，刘宁，
申请(专利权)人：湖南亚华乳业有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南,43