一种小分子量铁皮石斛多糖的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种小分子量铁皮石斛多糖的制备方法，其特征在于包括以下步骤：A、菌株活化与扩培：无菌条件下，取适量液体培养基配制燕麦镰刀菌菌悬液；B、利用高压微射流均质机反复高压均质5‑10次，得铁皮石斛破壁匀浆；C、发酵培养：在发酵罐中注入适量液体培养基，称取铁皮石斛破壁匀浆、燕麦镰刀菌种子液加入发酵罐中，发酵完成得发酵液；D、多糖纯化：发酵完成后，用脱色活性炭，静置吸附1h，再过滤去渣，得滤液，真空抽滤得沉淀，乙醇洗涤3次，真空干燥得小分子量铁皮石斛多糖。本发明专利技术制备的小分子量铁皮石斛多糖平均分子量小于300kDa，可以有效促进皮肤益生菌的增殖，并可提高皮肤表面朗格汉斯细胞密度，提升肌肤免疫力及防御力。

【技术实现步骤摘要】
一种小分子量铁皮石斛多糖的制备方法
本专利技术涉及天然产物有效成分提取
，特别涉及一种小分子量铁皮石斛多糖的制备方法。
技术介绍
铁皮石斛（DendrobiumcandidumWall.exLindl）为兰科（Orchidaceae）石斛属（Dendrobium）多年生附生型草本植物，富含石斛多糖、石斛碱、氨基酸、菲类化合物及多种微量元素，是我国传统的名贵中药材。铁皮石斛中多用于保健品行业，最主要的活性成分为石斛多糖，口服具有增强机体免疫力、抗肿瘤、抗氧化及延缓衰老等功效。目前化妆品产业也开始应用铁皮石斛多糖作为化妆品原料，但大多是发挥铁皮石斛多糖具备大分子量（>1000kDa）的持久保湿功效，而对于小分子量石斛多糖（平均分子量小于300kDa）在增强皮肤免疫力方面的功效研究则基本未见文献报道。皮肤作为生态系统，是微生物菌群赖以生存的栖身之地，每平方厘米约有十亿细菌在皮肤表面互利共生，形成微生态的防护盾。在人体皮肤的表面，存在着益生菌、有害菌，益生菌主要有双歧杆菌，嗜酸乳杆菌等乳酸菌属，有害菌则包括链球菌和金黄色葡球菌等。在皮肤卫生情况良好、正常菌群平衡，益生菌占种群优势，皮肤上的代谢产物（皮脂、汗液）大多被有益菌群利用，促使pH下降和皮肤屏障形成，能够抑制有害菌，皮肤状态正常；但当皮肤菌群紊乱，有害菌处于优势地位时，皮肤pH上升，皮肤屏障功能消失，会导致有害微生物侵蚀皮肤，发生炎症。朗格汉斯细胞(Langerhanscell，LC)是免疫反应中重要的抗原呈递细胞和单核吞噬细胞，能捕获和处理侵入皮肤的抗原，形成抗原肽-MHC分子复合物，并传递给T细胞，可使特异性T细胞增殖和激活，引发免疫应答。因此，只要能证明本专利技术制备的小分子量石斛多糖能促进皮肤表面益生菌的生长，及提高皮肤中朗格汉斯细胞的密度，就能够表征其在提高皮肤免疫力方面的作用。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题，是提供一种平均分子量小于300kDa的小分子量铁皮石斛多糖的制备方法，该方法制备的小分子量铁皮石斛多糖可以促进皮肤益生菌增殖，提高皮肤免疫力。为解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案：一种小分子量铁皮石斛多糖的制备方法，其特征在于包括以下步骤：A、菌株活化与扩培：无菌条件下，取适量液体培养基配制菌种浓度为1×105-1×106CFU/mL的菌悬液，所述菌种为燕麦镰刀菌，菌种保藏号CICC14038，然后取0.2-0.5mL菌悬液在PDA固体培养基表面划线，20-30℃温度下培养24-48h；挑取分散较好的单菌落接种至含有液体培养基成分的发酵摇瓶中进行扩培，培养温度20-30℃，摇瓶转速200r/min，供氧培养24-72h，氧浓度0.010-0.030mol/L，得燕麦镰刀菌发酵种子液，该发酵种子液中的燕麦镰刀菌浓度达1×104-1×105CFU/mL；所述液体培养基为含15.0-30.0g/L蔗糖、5.0-10.0g/L酵母粉的MS液体培养基；B、铁皮石斛破壁处理：50-52℃条件下，按质量比1:20将铁皮石斛粉末与蒸馏水预先混合后倒入不锈钢容器中，以刮边搅拌15rpm的速度，搅拌6-8h，然后利用高压微射流均质机反复高压均质5-10次，均质压力设90-130MPa，均质温度50-52℃，得铁皮石斛破壁匀浆；C、发酵培养：在发酵罐中注入适量液体培养基，称取步骤B所得铁皮石斛破壁匀浆投入发酵罐中，量取铁皮石斛破壁匀浆体积5.0-10.0%的燕麦镰刀菌种子液加入发酵罐中，然后加入KH2PO4和Na2HPO4缓冲溶液调节发酵罐中的料液pH至5.5-7.0，在25-35℃温度下供氧发酵3-5d，氧浓度控制在0.020-0.040mol/L，发酵完成得发酵液；D、多糖纯化：发酵完成后降至室温，向发酵罐中加入发酵液质量0.5-1.0%的硅藻土助滤剂及发酵液质量5.0-8.0%的脱色活性炭，静置吸附1h，再以板框压滤机过滤去渣，得滤液，然后将滤液与Sevage试剂按照体积比4.0-6.0:1.0进行混合，充分振荡30min，3000r/min转速离心10min，取上清液；再将上清液与质量浓度为95%的乙醇按质量比1.0:1.0-3.0进行混合，静置12-36h，真空抽滤得沉淀，用质量浓度为80%的乙醇洗涤3次，60℃下真空干燥24h，得小分子量铁皮石斛多糖。本专利技术制备的小分子量铁皮石斛多糖含量的测定：参照苯酚-硫酸法；小分子量铁皮石斛多糖的分子量测定：利用SephadexG-200凝胶排阻层析法；小分子量铁皮石斛多糖结构表征需利用高效液相色谱仪对酸解后多糖进行测定。结果表明：本专利技术制备的小分子量铁皮石斛多糖得率高于32.50%，平均分子量小于300KDa，其主链均由D-葡萄糖、D-半乳糖、L-鼠李糖、L-阿拉伯糖及D-甘露糖组成。本专利技术所用燕麦镰刀菌（Fusariumavenaceum）购于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号：CICC14038；所用PDA培养基购于杭州百思生物技术有限公司；所用蔗糖（CAS57-50-1）购于阿拉丁试剂（上海）有限公司，纯度≥99.5%；所用酵母粉（CAS119-44-8）购于北京鸿润宝顺科技有限公司，纯度≥99.0%；所用MS液体培养基为SIGMA公司生产，牌号M5519；所用铁皮石斛粉末为收购自浙江温州乐清市的2年生铁皮石斛鲜枝，自行清洗、晾干、粉碎至50目-100目；所用高压微射流均质机购于上海鲤跃精密机械贸易有限公司，型号M-110EH；所用发酵罐购于南京润泽生物工程设备有限公司，型号RZY-XGX；所用硅藻土购于嵊州市华力硅藻土制品有限公司，牌号为CD06，SiO2(%)≥85%；所用脱色活性炭购于湖州森盛活性炭有限公司，牌号为ZL-786，亚甲基兰吸附力12mL/0.1g；所用板框压滤机购于昆山市昆工环保机械有限公司，型号为XAMGZ/30U；所用气浴恒温振荡器购于江苏杰瑞尔电器有限公司，型号SHZ-82；所用离心机购于张家港市宇佼机械有限公司，型号为PSF-1000；所用真空抽滤机购于上海科升仪器有限公司，型号为ZF-30L；真空干燥机购于常州日翔干燥设备有限公司，型号SZG-350。本专利技术中制备的小分子量铁皮石斛多糖对青春双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、两歧双歧杆菌及嗜酸乳杆菌的生长增殖有促进作用，以实施例1中制备的产品为例，实验如下：将活化好的4种菌株分别以1.0%的接种量（浓度为106CFU/mL）接种于分别添加小分子量铁皮石斛多糖质量分数0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的MRS培养基中，每组3个平行实验，38℃条件下培养24h，利用紫外可见分光光度计测定波长600nm处各培养液的吸光度值（OD600nm）。所用青春双歧杆菌(Bifidobacteriumadolesentis)菌种编号CICC6070，婴儿双歧杆菌（Bifidobacteriuminfantis）菌种编号CICC6069，两歧双歧杆菌（Bifidobacteriumbifidum）菌种编号CICC6071，嗜酸乳杆菌（Lactobacillusacidophilus）菌种编号CICC6096均购于中国工业微生物菌种保藏管理中心；所用MRS培养基购于青岛海博生物技术有限公司；所用紫外可见本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种小分子量铁皮石斛多糖的制备方法，其特征在于包括以下步骤：A、菌株活化与扩培：无菌条件下，取适量液体培养基配制菌种浓度为1×10

【技术特征摘要】
1.一种小分子量铁皮石斛多糖的制备方法，其特征在于包括以下步骤：A、菌株活化与扩培：无菌条件下，取适量液体培养基配制菌种浓度为1×105-1×106CFU/mL的菌悬液，所述菌种为燕麦镰刀菌，菌种保藏号CICC14038，然后取0.2-0.5mL菌悬液在PDA固体培养基表面划线，20-30℃温度下培养24-48h；挑取分散较好的单菌落接种至含有液体培养基成分的发酵摇瓶中进行扩培，培养温度20-30℃，摇瓶转速200r/min，供氧培养24-72h，氧浓度0.010-0.030mol/L，得燕麦镰刀菌发酵种子液，该发酵种子液中的燕麦镰刀菌浓度达1×104-1×105CFU/mL；所述液体培养基为含15.0-30.0g/L蔗糖、5.0-10.0g/L酵母粉的MS液体培养基；B、铁皮石斛破壁处理：50-52℃条件下，按质量比1:20将铁皮石斛粉末与蒸馏水预先混合后倒入不锈钢容器中，以刮边搅拌15rpm的速度，搅拌6-8h，然后利用高压微射流均质机反复高压均质5-10次，均质压力设90-130M...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛绘，张金龙，王丽娜，杨盼盼，蒋丽刚，毕永贤，李文倩，
申请(专利权)人：珀莱雅化妆品股份有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33