用于生产具有耐温性脂肪酶的基因制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体公开了一种用于生产具有耐温性脂肪酶的基因及由所述基因所表达的耐温性脂肪酶。本发明专利技术的基因所表达的脂肪酶耐温性好、具有开发潜力，具有广泛和实际的应用价值，如可用于面制品与烘焙制品的增白。

【技术实现步骤摘要】
用于生产具有耐温性脂肪酶的基因
本专利技术属于生物
，具体涉及一种用于生产具有耐温性脂肪酶的基因。
技术介绍
脂肪酶(Lipase，甘油酯水解酶)隶属于羧基酯水解酶类，能够逐步的将甘油三酯水解成甘油和脂肪酸。脂肪酶存在于含有脂肪的动、植物和微生物(如霉菌、细菌等)组织中。包括磷酸酯酶、固醇酶和羧酸酯酶。脂肪酸广泛的应用于食品、药品、皮革、日用化工等方面。然而，在脂肪酶的应用中，其活性受温度影响较大，温度较高时，脂肪酶的酶活急剧下降，影响其商业化推广或应用。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术的目的之一在于提供了一种用于生产具有耐温性脂肪酶的基因；本专利技术的目的之二在于提供一种由所述基因所表达的耐温性脂肪酶。本专利技术是通过以下技术方案来实现的：一种用于生产具有耐温性脂肪酶的基因，所述基因的序列如下：一种由上述基因所表达的耐温性脂肪酶。较佳地，所述耐温性脂肪酶于50～60℃下处理50～90分钟后的酶活为87.5％～90.6％。应用上，所述耐温性脂肪酶可用于增白面制品，如面条，或增白烘焙制品，如馒头等。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术的基因所表达的脂肪酶耐温性良好、具有开发潜力，具有广泛和实际的应用价值，如可用于面制品与烘焙制品的增白。附图说明图1是本专利技术线性化质粒APYLL-pPICZαA的琼脂糖电泳检测，其中，线M，DL15000bpmarker；线2，线性化APYLL-pPICZαA。图2是BMMY-罗丹明B平板法筛选重组子的示意图。具体的实施方式下面结合具体实施方式对本专利技术作进一步的详细说明，以助于本领域技术人员理解本专利技术。本专利技术用于生产具有耐温性脂肪酶的基因(用APYLL-pPICZαA表示)的序列如下：一、基因的表达寄主：毕赤酵母菌株X-33和GS115。当然，可表达脂肪酶基因的其他寄主都可应用至本专利技术。基因合成：本专利技术用于生产具有耐温性脂肪酶的基因由上海捷瑞公司合成。1.1表达菌株构建1.1.1质粒提取参照广州东盛质粒小提试剂盒使用说明书。1.1.2重组质粒APYLL-pPICZαA的线性化和回收将所得的重组质粒APYLL-pPICZαA用SacI进行线性化处理，37℃下酶切反应1h，反应体系如下：将酶切反应溶液混匀后放置于37℃水浴，1h后取出，用凝胶纯化回收试剂盒进行回收(参见天根胶回收试剂盒使用说明书)。1.1.3毕赤酵母菌株感受态的制备及电转化参见Invitrogen的pPICZαA,B,andC用户操作手册。1.1.4结果将经酶切验证和测序验证后正确的重组质粒APYLL-pPICZαA用SacI进行线性化处理，酶切产物回收后用1％琼脂糖凝聚电泳进行鉴定，结果如图1所示。1.2具脂肪酶活性的转化子的筛选1.2.1初筛挑取YPDS平板上生长最快的单克隆子分别点接于YPD(用于保种)和BMMY-罗丹明B平板(用于诱导)平板上，30℃倒置恒温培养3～5d；每隔24h在BMMY-罗丹明B平板的盖子上添加100μL甲醇对重组子进行诱导表达，在培养过程中，根据水解圈的相对大小选出脂肪酶酶活性最强的10个转化子，依次编号为1#，2#，3#～10#，平板筛选结果如图2所示。1.2.2复筛将选定的10个转化子分别接种含10mLBMGY液体培养基中(100mL规格摇瓶)，30℃250rpm培养至OD600＝6.0；3,000g离心5min收集菌体，用2mLBMMY液体培养基重悬细胞后转移至50mLBMMY液体培养基中，使其OD600＝1.0；30℃250rpm继续诱导培养，每隔24h添加一次甲醇使其终浓度为0.5％，48h后开始取样测酶活性，取样时间点为48h、72h、96h、120h，所取样品在3,000g离心3min后收集上清，采用滴定法测脂肪酶酶活性，确定活性最高的转化子及其诱导条件。1.2.3结果选取初筛获得的脂肪酶活性较高的10个转化子进一步进行筛选，观察其三角瓶水平的表达情况，采用碱性滴定法测定发酵液上清中的脂肪酶活性，APYLL-pPICZαA的酶活测定结果见表1。表1摇床水平三角瓶中各转化子的脂肪酶酶活性诱导时间(h)APYLL-pPICZαA酶活性(U/mL)484272559657120551.3脂肪酶活力测定本实验采用碱式滴定法测定脂肪酶活力。1.3.1原理脂肪酶在一定条件下，能使甘油三脂水解成脂肪酸、甘油二酯、甘油单脂和甘油，所释放的脂肪酸可用标准碱溶液进行中和滴定，用PH计或酚肽指示液指示反应终点，根据消耗的碱量，计算其酶活力。反应式为：RCOOH+NaOH→RCOONa+H2O1.3.2操作步骤1)取两个50ml三角瓶，分别于空白管(A)和样品管(B)中各加入底物溶液4.00ml橄榄油乳化液(橄榄油：PVA＝1:3，v/v)和5.00ml磷酸缓冲液(100mM,pH7.0),再于A管中加入95％乙醇15.00ml，于40℃水浴中预热5min，然后于A、B管中各加待测酶液1.00ml，立即混匀计时，于40℃水浴中准确反应10min，于B管中立即补加95％乙醇15.0ml终止反应，取出；2)于空白和样品溶液中各加酚肽指示液2滴，用50mMNaOH标准溶液滴定，直至微红色并保持30s不褪色为滴定终点，记录消耗50mMNaOH标准溶液的体积。1.3.3酶活计算酶活定义:1g固体酶粉(或1mL液体酶)，在40℃温度和pH7.0条件下，1min水解橄榄油(oliveoil)产生1μmol的可滴定的脂肪酸，即为1个酶活力单位，以U/g(U/ml)表示。计算方法：脂肪酶制剂的酶活力按下式计算X1＝(V1-V2)*c*50*n1/0.05*1/10式中：X1-----样品的酶活力，U/g(U/ml)V1----滴定样品时消耗氢氧化钠标准溶液的体积,单位为毫升(ml)；V2----滴定空白时消耗氢氧化钠标准溶液的体积,单位为毫升(ml)c----氢氧化钠标准溶液浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；50---0.05mol/L氢氧化钠溶液1.00ml相当于脂肪酸50μmol；n1----样品的稀释倍数；0.05----氢氧化钠标准溶液浓度换算系数；1/10----反应时间10min,以1min计。所得结果表示至整数。1.3.4耐温性测试以上述脂肪酶活力测定方法测试结果。对比例：LBK-B4000(馒头专用脂肪酶，绿微康)：46.5mg蛋白/g粉末(蛋白含量4.65％)；LipozymeTL100L(用于油脂加工，Novozymes)：24.2mg蛋白/mL原酶液(蛋白含量2.42％)；CaL-B(用于有机合成，Novozymes)：9.24mg蛋白/mL原酶液(蛋白含量0.924％)。将APYLL-pPICZαA发酵上清液、LBK-B4000的稀释液(稀释100倍)、LipozymeTL100L的稀释液(稀释100倍)和CaL-B的原酶液置于50℃～60℃下温浴(本实施例中取60℃)，分别于10、20、30、40、50、60、90和135min去样测残余酶活，以初始发酵上清液的酶活为100％。测试结果如下表2所示：表2：各脂肪酶酶在:60℃下的稳定性由表2可知：APYLL-pPICZαA的耐温性得到很大的提高，60℃下的稳定性超过135分钟，LBK-B4000于60℃下的稳本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于生产具有耐温性脂肪酶的基因，其特征在于，所述基因的序列如下：

【技术特征摘要】
1.一种用于生产具有耐温性脂肪酶的基因，其特征在于，所述基因的序列如下：2.一种由权利要求1所述的基因所表达的耐温性脂肪酶。3.根据权利要求2所述的耐温性脂肪酶，其特征在于，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：王耀辉，谢建华，王魁，李小明，何志梅，徐莉敏，王源丰，
申请(专利权)人：东莞泛亚太生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44