一个控制水稻籽粒高镉积累的基因突变位点及其应用制造技术

技术编号:15682916 阅读:102 留言:0更新日期:2017-06-23 14:04
本发明专利技术公开了一个控制水稻籽粒高镉积累的基因突变位点及其应用。一个控制水稻籽粒高镉积累的基因突变位点,所述突变位点位于水稻OsHMA3基因起始密码子ATG下游+1138位核苷酸,且存在A/C多态性,所述突变位点与水稻籽粒镉含量显著相关,该位点具有AA基因型的水稻籽粒镉含量显著低于具有CC基因型的水稻籽粒镉含量。由于所述突变位点存在于水稻粳稻品种中,采用简易分子标记检测该突变位点对于规避高镉积累品种的使用风险及辅助选育低镉积累新品系都具有重要经济和社会效益。

【技术实现步骤摘要】
一个控制水稻籽粒高镉积累的基因突变位点及其应用
本专利技术属于作物遗传育种领域,涉及一个控制水稻籽粒高镉积累的基因突变位点及其应用。
技术介绍
镉是一种对动植物均具有很强毒性的重金属元素,随着我国工业化、城镇化的快速发展,农田镉污染问题日益突出。水稻是我国主要的粮食作物,水稻镉污染日趋严重,已成为不容忽视的食品安全问题。近年来关于水稻吸收、运输及解毒镉的机理已经开展了大量的研究工作,并取得了一些重要进展,为遗传改良阻控水稻重金属镉积累提供了理论基础和技术途径。国内外研究表明,不同水稻品种籽粒镉的积累能力差异很大,籽粒镉浓度的差异高达10倍以上,而且这些性状的遗传性强。通常籼稻品种镉积累能力较粳稻高,但是也有一些粳稻品种具有较强的镉积累能力。不同水稻品种间,参与重金属镉吸收或运输的关键基因的表达水平、以及所编码的转运蛋白对镉跨膜运输活性的不同,是导致品种间镉积累能力的差异的主要原因。研究表明,镉是通过铁、锌、锰等植物必需元素的吸收途径进入植物体内。水稻OsHMA3是一个P‐1B型重金属ATP酶,主要在根系表达,定位于液泡膜上,具有运输镉的能力。水稻中OsHMA3转运蛋白的主要功能是将镉运输进入液泡中储存,从而限制镉由根系向地上部的运输。国际上已经有通过遗传改良阻控作物重金属积累的成功例子,如加拿大科学家已培育并注册了5种低镉的硬粒小麦新品种,美国培育了低镉的向日葵品种。最近,日本科学家采用放射性诱变,筛选出低镉水稻突变株,其根系镉的吸收及籽粒镉浓度比对照降低90%以上,种植在镉污染的土壤上稻米镉浓度也没有超标,而且生长及产量均不受影响,分析表明突变的基因为编码镉和锰的运转蛋白Nramp5,目前日本正在应用这一突变株开展低镉水稻品种的培育。这些例子充分说明通过遗传改良培育重金属低积累的品种是完全可行的。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的上述不足,提供一个控制水稻籽粒高镉积累的基因突变位点。本专利技术的另一目的是提供检测该突变位点的引物对。本专利技术的又一目的是提供该突变位点和引物对的应用。本专利技术的目的可通过如下技术方案实现:一个控制水稻籽粒高镉积累的基因突变位点,所述突变位点位于水稻OsHMA3基因起始密码子ATG下游+1138位核苷酸,且存在A/C多态性,所述突变位点与水稻籽粒镉含量显著相关,该位点具有AA基因型的水稻籽粒镉含量显著低于具有CC基因型的水稻籽粒镉含量。本专利技术根据已公布的水稻日本晴(Nipponbare)序列设计OsHMA3基因的全长PCR引物,对籽粒镉积累存在显著差异的水稻品种(图1;图2)的cDNA进行PCR扩增和测序,同时与日本晴的序列进行了比对,发现了一些单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)。这些SNP会导致OsHMA3所编码氨基酸的变异(图3)。通过酵母异源表达这些不同水稻品种来源的OsHMA3蛋白发现,在OsHMA3蛋白80位和380位氨基酸的变异会导致OsHMA3蛋白功能丧失(图3;图4)。OsHMA3基因起始密码子ATG下游+1138位的SNP导致了HMA3蛋白第380位氨基酸的变异。OsHMA3基因起始密码子ATG下游+1138位核苷酸位点存在A/C多态性(SEQIDNO.4),所述OsHMA3基因起始密码子ATG下游+1138位SNP位点与水稻籽粒镉含量显著相关。水稻OsHMA3基因起始密码子ATG下游+1138位核苷酸位点具有AA基因型的水稻籽粒镉含量显著低于具有CC基因型的水稻籽粒镉含量。利用这个SNP设计了一个dCAPS分子标记,对不同水稻品种的基因组DNA进行PCR扩增,PCR产物经一个限制性内切酶Hpy188I酶切,在电泳中可检测到两种大小不同条带,籽粒镉含量高的品种的条带大小为189bp(basepair),籽粒镉含量低的品种条带大小为163bp(图5),这两种条带在聚丙烯酰胺凝胶电泳中具有很好的多态性(图6)。该dCAPS标记能分析待测水稻品种中OsHMA3基因起始密码子ATG下游+1138位核苷酸的多态性。一种用于检测水稻基因组中是否存在权利要求1所述的基因突变位点的引物对,正向引物F1:5'‐TGGAAGCTGGCTCTGGTGATGCTTCTG‐3'(SEQIDNO.1),反向引物R1:5'‐TCTGGTGATCGTCCCGGTCTT‐3'(SEQIDNO.2)。一种检测水稻基因组中是否存在本专利技术所述的基因突变位点的方法,包括:以待测水稻基因组DNA为模板,用SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示引物进行PCR扩增,扩增得到OsHMA3基因,PCR产物经一个限制性内切酶Hpy188I酶切,电泳结果如果出现189bp的条带,表明待测水稻品种中OsHMA3基因起始密码子ATG下游+1138位核苷酸存在所述的基因突变位点,其基因型为CC,该水稻样品为籽粒镉含量高的品种;如果出现163bp的条带,表明水稻品种中OsHMA3基因起始密码子ATG下游+1138位核苷酸位点未产生突变,基因型为AA,该水稻样品为籽粒镉含量低的品种。本专利技术所述的基因突变位点在水稻籽粒低镉积累品种的辅助选择育种中的应用。本专利技术所述的引物对在检测本专利技术所述的基因突变位点中的应用。本专利技术所述的引物对在水稻籽粒低镉积累品种的辅助选择育种中的应用。有益效果:本专利技术提供了控制水稻籽粒镉积累基因OsHMA3序列一个新的突变位点及其检测方法,可以用于水稻OsHMA3基因的辅助选择育种。附图说明图1为不同品种水稻编号、名称及亚种类型;图2为不同品种水稻籽粒镉含量差异;图3为不同品种水稻OsHMA3氨基酸变异位点;图4为在酵母异源系统中验证不同品种水稻OsHMA3蛋白活性;图5为本专利技术检测所述突变位点的dCAPS分子标记的设计图;图6为籽粒高镉品种与低镉品种水稻dCAPS分子标记的电泳分析图;图7为通过本专利技术所述的dCAPS分子标记检测的籽粒高镉品种与低镉品种水稻地上部镉含量差异。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术,但不用来限制本专利技术的范围。在不背离本专利技术精神和本质的情况下,对本专利技术方法、步骤或条件所作的修改或替换,均属于本专利技术的范围。实施例1本专利技术所述的检测所述突变位点的方法,包括以下步骤:1、引物设计:根据对不同水稻品种(图1)OsHMA3基因的测序分析,即序列SEQIDNO.5,在OsHMA3基因起始密码子ATG下游+1138位SNP位点及其周围约200bp处,设计一对dCAPS分子标记的PCR引物,序列为正向引物:5'‐TGGAAGCTGGCTCTGGTGATGCTTCTG‐3'(SEQIDNO.1),反向引物:5'‐TCTGGTGATCGTCCCGGTCTT‐3'(SEQIDNO.2)。引物可委托金斯瑞公司合成。2、DNA提取:以水稻叶片为材料提取基因组DNA,已报道的DNA提取方法很多,可任意选择一种。本专利技术是采用的是陈文岳等(中国水稻科学,2005,19:561‐563)报道的一种水稻DNA简易提取法。3、PCR扩增:在0.2mL的PCR扩增专用薄壁管中,加入20ng水稻基因组DNA、正反向引物各0.25μM、4种dNTP(dCTP、dGTP、dATP、dTTP)各100μM、10μL2×GCBufferI、1个酶活力单位本文档来自技高网
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一个控制水稻籽粒高镉积累的基因突变位点及其应用

【技术保护点】
一个控制水稻籽粒高镉积累的基因突变位点,其特征是:所述突变位点位于水稻OsHMA3基因起始密码子ATG下游+1138位核苷酸,且存在A/C多态性,所述突变位点与水稻籽粒镉含量显著相关,该位点具有AA基因型的水稻籽粒镉含量显著低于具有CC基因型的水稻籽粒镉含量。

【技术特征摘要】
1.一个控制水稻籽粒高镉积累的基因突变位点,其特征是:所述突变位点位于水稻OsHMA3基因起始密码子ATG下游+1138位核苷酸,且存在A/C多态性,所述突变位点与水稻籽粒镉含量显著相关,该位点具有AA基因型的水稻籽粒镉含量显著低于具有CC基因型的水稻籽粒镉含量。2.一种用于检测水稻基因组中是否存在权利要求1所述的基因突变位点的引物对,其特征在于正向引物如SEQIDNO.1所示,反向引物如SEQIDNO.2所示。3.一种检测水稻基因组中是否存在权利要求1所述的基因突变位点的方法,其特征在于包括:以待测水稻基因组DNA为模板,用SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示引物进行PCR扩增,扩增得到OsHM...

【专利技术属性】
技术研发人员:赵方杰黄朝锋唐仲闫佳莉王佩同
申请(专利权)人:南京农业大学
类型:发明
国别省市:江苏,32

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