应用于质粒DNA提取的快速沉淀缓冲液及其应用制造技术

本发明专利技术涉及应用于质粒DNA提取的快速沉淀缓冲液及其应用。其中，该快速沉淀缓冲液综合离液盐和表面活性剂的效果，能够中和NaOH，并且提高体系中的盐浓度，使蛋白质、基因组DNA和RNA发生盐析沉淀，碱裂解后加入所述应用于质粒DNA提取的快速沉淀缓冲液，使得大部分蛋白质、基因组DNA、非超螺旋质粒DNA和RNA都以不溶物状态存在，形成更紧密的团块，避免形成絮状的漂浮在溶液表面的蛋白物质，极大的缩短了离心的时间，不仅能用于高拷贝和低拷贝质粒的提取，也适用于不同培养基培养大肠杆菌质粒的提取，大大节省了实验研究者的时间，提高了实验效率。

【技术实现步骤摘要】
应用于质粒DNA提取的快速沉淀缓冲液及其应用
本专利技术涉及生物
，具体地，本专利技术涉及一种应用于质粒DNA提取的快速沉淀缓冲液、纯化质粒DNA的方法、制备质粒DNA的方法、该缓冲液在制备、纯化质粒DNA中的用途和试剂盒。
技术介绍
质粒DNA的提取和纯化是分子生物学的基本步骤之一，涉及了基因克隆、基因序列分析、核酸疫苗、基因治疗和各种基因重组等领域。质粒一般有三种构象，即超螺旋，线形和开环质粒(开环质粒是指双链环状的质粒DNA有部分解链，因此电泳速度最慢)。三种构象的质粒在琼脂糖电泳的前后顺序是超螺旋>线形>开环，线形的质粒在中间，而开环的质粒在最后。判断质粒好坏的一个指标就是超螺旋质粒的含量多少。因为用质粒转染真核细胞时，超螺旋的质粒效率最高，所以要求质粒中超螺旋质粒的含量要在90％以上，这也是对作为核酸疫苗重组质粒的要求。从原核生物中提取和纯化质粒DNA的经典步骤为：菌体裂解、质粒分离和纯化。目前菌体裂解最常用的方法有：一步法质粒提取法和碱裂解法。一步法质粒提取法是由德国Eppendorf公司专利技术。它是一种基于溶菌酶裂解细菌的提取方法。该方法使用含有溶菌酶和去污剂的裂解液裂解细胞，裂解产物澄清无粘性，裂解后无需离心可直接与过滤膜进行结合，然后通过快速离心的清洗和洗脱得到超螺旋的质粒DNA。该提取方法虽然方便，快捷和重复性好，但不适合于低拷贝质粒的提取和丰富培养基培养大肠杆菌质粒的提取。碱裂解法质粒DNA纯化技术是1979年由Birnboim&Doly专利技术。该方法仍是分子克隆研究中最常用的方法之一，其操作包括三种溶液处理，一般需要20分钟左右的时间才能完成质粒的提取。该提取方法适用面较广，重复性好，但实验周期相对较长，超螺旋质粒含量低，影响了研究者的实验进程。现有质粒DNA的提取和纯化方法仍然有待改进。
技术实现思路
本专利技术旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。本专利技术是基于专利技术人对以下事实和问题的发现和认识作出的：基于碱裂解法，采用一种创新的应用于质粒DNA提取的快速沉淀缓冲液，可以对整个质粒提取流程进行优化。快速沉淀缓冲液综合离液盐和表面活性剂的效果，可以促进质粒提取过程中的变性蛋白形成更紧密的团块，避免形成絮状的漂浮在溶液表面的蛋白物质。极大的缩短了离心的时间，可以使整个质粒提取由传统的20分钟缩短到6分钟左右，同时超螺旋质粒含量在90％以上，不仅能用于高拷贝和低拷贝质粒的提取，也适用于不同培养基培养大肠杆菌质粒的提取，大大节省了实验研究者的时间，提高了实验效率。根据本专利技术的第一方面，本专利技术提出一种应用于质粒DNA提取的快速沉淀缓冲液，包含：碘化钠；十二烷基肌氨酸钠；脱氧胆酸钠；3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸；乙酸钾；乙酸；以及去离子水。本专利技术中所述应用于质粒DNA提取的快速沉淀缓冲液相对于现有的缓冲液，添加了碘化钠、十二烷基肌氨酸钠、脱氧胆酸钠和3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸，其中，碘化钠是一种离液盐，可以起到裂解细胞、变性蛋白，提高溶液体系中的盐浓度，并使释放的蛋白和核酸吸附到硅胶吸附膜上的作用。而十二烷基肌氨酸钠、脱氧胆酸钠和3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸均属于表面活性剂类的化学试剂，对细胞起到辅助裂解作用，并且在离液盐存在的条件下，可以是质粒提取过程中形成的变性蛋白形成更紧密的团块，避免形成絮状的漂浮在溶液表面的蛋白物质，极大的缩短了离心的时间。同时，乙酸钾和乙酸使缓冲液处于酸性环境，起到中和作用，使碱裂解出的质粒起到复性的作用。从而，碱裂解后加入该应用于质粒DNA提取的快速沉淀缓冲液，使得大部分蛋白质、基因组DNA、非超螺旋质粒DNA和RNA都以不溶物状态存在，离心1min后即可将所有不溶物沉淀到管底，上清即可进行下一步操作。极大的缩短了离心的时间，可以使整个质粒提取由传统的20分钟缩短到6分钟左右，同时超螺旋质粒含量在90％以上，不仅能用于高拷贝和低拷贝质粒的提取，也适用于不同培养基培养大肠杆菌质粒的提取，大大节省了实验研究者的时间，提高了实验效率。根据本专利技术的一些实施例，所述应用于质粒DNA提取的快速沉淀缓冲液，基于100ml所述缓冲液，所述缓冲液包含：碘化钠60～75克；十二烷基肌氨酸钠0.25-0.5克；脱氧胆酸钠0.25-0.5克；3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸0.5-1.5克；乙酸钾2～6克；乙酸1～5毫升；以及余量去离子水。利用所述应用于质粒DNA提取的快速沉淀缓冲液，整个优化的质粒提取流程可在6分钟内完成，同时超螺旋质粒含量在90％以上，大大节省了实验研究者的时间，进一步地提高了实验效率。根据本专利技术的第二方面，本专利技术提供一种纯化质粒DNA的方法，包括：(1)将含有质粒DNA的样品与前述应用于质粒DNA提取的快速沉淀缓冲液进行混合；(2)将步骤(1)中所得到的混合液进行离心，并收集上清液；以及(3)将步骤(2)中所获得的上清液进行亲和层析处理，以便获得经过纯化的质粒DNA。利用所述方法，质粒提取流程可在6分钟内完成，同时超螺旋质粒含量在90％以上，大大节省了实验研究者的时间，提高了实验效率。并且所述方法具有高效、快速、简洁，利用所述方法纯化获得的质粒DNA可适用于各种常规操作，包括酶切、PCR、测序、连接、转化、文库筛选、体外翻译、转染一些常规的传代细胞等。根据本专利技术的一些实施例，所述含有质粒DNA的样品是通过对含有质粒DNA的微生物进行碱裂解而获得的。根据本专利技术的一些实施例，所述碱裂解包括：(a-1)将悬浮液加入所述含有质粒DNA的微生物中，以便获得第一溶液；(a-2)将碱裂解液加入所述第一溶液中，以便获得所述含有质粒DNA的样品。由此，可以进一步地提高实验效率。根据本专利技术的一些实施例，所述悬浮液、所述碱裂解液和所述应用于质粒DNA提取的快速沉淀缓冲液的体积比为5:5:14。由此，可以进一步地提高实验效率。根据本专利技术的一些实施例，所述方法中将含有质粒DNA的样品与所述应用于质粒DNA提取的快速沉淀缓冲液进行混合1min后，将所得到的混合液进行离心，并收集上清液。由此，可以进一步地缩短实验时间，提高实验效率。根据本专利技术的一些实施例，所述方法中采用硅膜吸附柱进行所述亲和层析处理。根据本专利技术的第三方面，本专利技术提出一种制备质粒DNA的方法，包括：(1)将1～3毫升含有质粒的大肠杆菌在培养基中进行培养后，于13000转/分钟，离心1min，以便获得沉淀物；(2)将75微升悬浮液加入所述沉淀中，涡旋振荡至沉淀完全溶解，以便获得第一溶液；(3)将75微升碱裂解液加入所述第一溶液中，温和地上下翻转至溶液澄清，以便获得第二溶液；(4)将210微升权利要求1或2所述应用于质粒DNA提取的快速沉淀缓冲液加入至所述第二溶液中，以便获得第三溶液；(5)将所述第三溶液于13000转/分钟离心1min，以便获得上清液；(6)将所述上清液移入硅膜吸附柱中，于13000转/分钟离心1min除去废液，加入300微升漂洗液，于13000转/分钟离心30s除去废液，加入50～100微升洗脱缓冲液，进行洗脱离心，以便获得含有质粒DNA溶液。利用所述方法，质粒提取流程可在6分钟内完成，同时超本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种应用于质粒DNA提取的快速沉淀缓冲液，其特征在于，所述快速沉淀缓冲液包含：碘化钠；十二烷基肌氨酸钠；脱氧胆酸钠；3‑[(3‑胆固醇氨丙基)二甲基氨基]‑1‑丙磺酸；乙酸钾；乙酸；以及去离子水。

【技术特征摘要】
1.一种应用于质粒DNA提取的快速沉淀缓冲液，其特征在于，所述快速沉淀缓冲液包含：碘化钠；十二烷基肌氨酸钠；脱氧胆酸钠；3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸；乙酸钾；乙酸；以及去离子水。2.根据权利要求1所述快速沉淀缓冲液，其特征在于，基于100ml所述快速沉淀缓冲液，所述快速沉淀缓冲液包含：碘化钠60～75克；十二烷基肌氨酸钠0.25～0.5克；脱氧胆酸钠0.25～0.5克；3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸0.5～1.5克；乙酸钾2～6克；乙酸1～5毫升；以及余量去离子水。3.一种纯化质粒DNA的方法，其特征在于，包括：(1)将含有质粒DNA的样品与权利要求1或2所述应用于质粒DNA提取的快速沉淀缓冲液进行混合；(2)将步骤(1)中所得到的混合液进行离心，并收集上清液；以及(3)将步骤(2)中所获得的上清液进行亲和层析处理，以便获得经过纯化的质粒DNA。4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述含有质粒DNA的样品是通过对含有质粒DNA的微生物进行碱裂解而获得的。5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述碱裂解包括：(a-1)将悬浮液加入所述含有质粒DNA的微生物中，以便获得第一溶液；(a-2)将碱裂解液加入所述第一溶液中，以便获得所述含有质粒DNA的样品。6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述悬浮液、所述碱裂解液和所述纯化质粒DNA的缓冲液的体积比为5:5:14。...

【专利技术属性】
技术研发人员：邹爱兰，韩典霖，刘玉方，李晓晨，孙克非，
申请(专利权)人：天根生化科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11