一种脂肪干细胞高效诱导分化剂和诱导分化培养基制造技术

本发明专利技术公开了一种脂肪干细胞高效诱导分化剂和诱导分化培养基。本发明专利技术属于干细胞领域，涉及干细胞诱导分化，具体涉及一种脂肪干细胞高效诱导分化剂和诱导分化培养基，高效诱导其定向分化为膀胱平滑肌细胞，诱导分化剂和诱导分化培养基中均含有有效量的血浆外泌体。本发明专利技术证明血浆外泌体可有效诱导脂肪干细胞定向分化为膀胱平滑肌细胞，可用于制备脂肪干细胞高效诱导分化剂和诱导分化培养基，高效诱导其定向分化为膀胱平滑肌细胞。

【技术实现步骤摘要】
一种脂肪干细胞高效诱导分化剂和诱导分化培养基
本专利技术属于干细胞领域，涉及干细胞诱导分化，具体涉及一种脂肪干细胞高效诱导分化剂和诱导分化培养基，高效诱导其定向分化为膀胱平滑肌细胞。
技术介绍
泌尿系组织器官的先天畸形和后天结构或功能的缺失是临床泌尿外科领域常常面临的问题，目前泌尿系修复重建仍依赖于利用胃肠节段替代缺损的膀胱等器官。组织工程技术为泌尿系修复重建提供了新的方向，但分化成熟的膀胱平滑肌细胞作为组织工程种子细胞存在来源不足、容易老化、缺乏自我更新能力等缺点。因此，干细胞作为种子细胞构建组织工程化膀胱成为研究热点。目前大量研究者采用骨髓间充质干细胞进行诱导分化研究，由于骨髓中的间充质干细胞含量稀少，且取材不便，在应用上存在明显的局限性。脂肪干细胞与骨髓间充质干细胞等相比，具有来源丰富、取材简单、便于培养、不存在组织配型及免疫排斥问题、可跨胚层多向分化、增殖速度快等显著的优越性，是优秀的组织工程种子细胞。脂肪干细胞是由中胚层发育而来的多能干细胞，在特殊的生长因子和环境等诱导培养条件下，可以向不同的谱系分化。已经证实脂肪干细胞能诱导分化为同样中胚层来源的成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞，还可以跨胚层分化为内胚层来源的肝细胞、胰岛β样细胞，外胚层来源的神经细胞、心肌细胞、表皮细胞等，如图1所示。目前脂肪干细胞诱导分化中常用的诱导液主要成分如下表所示：华西医院杨进等以TGF-β和抗坏血酸为诱导剂建立了体外诱导脂肪干细胞向膀胱平滑肌细胞定向分化体系，但是该体系不稳定，在一些情况下会分化为软骨细胞。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种脂肪干细胞高效诱导分化剂和诱导分化培养基，以高效诱导脂肪干细胞定向分化为膀胱平滑肌细胞。实现本专利技术上述目的技术方案如下：血浆外泌体在诱导脂肪干细胞分化为膀胱平滑肌细胞中的应用。优选地，所述脂肪干细胞为人源脂肪干细胞，所述血浆外泌体为人源血浆外泌体。一种诱导脂肪干细胞分化为膀胱平滑肌细胞的方法，培养基中含有有效量的血浆外泌体。优选地，所述培养基为H-DMEM培养基，其中含有有效量的血浆外泌体。优选地，H-DMEM培养基含10-20％胎牛血清。优选地，所述脂肪干细胞为人源脂肪干细胞，所述血浆外泌体为人源血浆外泌体。一种用于诱导脂肪干细胞分化为膀胱平滑肌细胞的诱导剂，含有有效量的血浆外泌体。优选地，所述脂肪干细胞为人源脂肪干细胞，所述血浆外泌体为人源血浆外泌体。一种用于诱导脂肪干细胞分化为膀胱平滑肌细胞的培养基，含有有效量的血浆外泌体。优选地，所述脂肪干细胞为人源脂肪干细胞，所述血浆外泌体为人源血浆外泌体。本专利技术的突出优点：本专利技术证明血浆外泌体可有效诱导脂肪干细胞定向分化为膀胱平滑肌细胞，可用于制备脂肪干细胞高效诱导分化剂和诱导分化培养基，高效诱导其定向分化为膀胱平滑肌细胞。附图说明图1为脂肪干细胞诱导分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞和肌细胞示意图；图2为膀胱平滑肌细胞特异蛋白α-SMA和Calponin的WesternBlot测定结果。具体实施方式下面就结合实施例具体介绍本专利技术的实质性内容，由于篇幅原因，实验过程的描述无法做到非常详细，凡是实验中未详细描述的部分均为本领域技术人员熟知的常规操作。一、实验材料制备血浆外泌体的血浆来源于健康成人，健康成人指体检正常并排除其他慢性疾病的健康成年人。脂肪来源为20-40岁健康女性脂肪抽吸术中收集，术前排除内分泌及慢性病史。术前均签立知情同意书。二、实验方法1、血浆外泌体的制备用EDTA抗凝管采集健康成人的静脉血5ml，静置10min后，常温下以3000r/min离心10min，可见分为两层，用移液枪吸取上层透明淡黄色液体即血浆，分装成1ml于1.5mlEP管后，置于-80℃保存。健康成人指体检正常并排除其他慢性疾病的健康成年人。使用Invitrogen外泌体提取试剂盒提取血浆外泌体，按说明书操作，具体步骤如下：(1)样品准备：取出于-80℃存储的血浆样品置37℃水浴至完全液态，并置于冰上；室温下2000×g离心20min去除细胞和碎片；用移液枪吸取上清液至新的离心管，室温下10000×g离心20min以除去碎片；吸取上清液至新的离心管，并将其放置在冰上直至开始分离。(2)外泌体分离：吸取适当体积血浆至新离心管中，加入0.5×血浆体积的1×PBS，涡旋混匀样本；加入0.2×(血浆体积+1×PBS体积)的外泌体沉淀试剂至样品中，涡旋混匀血浆/试剂混合物；在室温下孵育10min后，室温下10000×g离心5min，用移液枪吸出上清液并丢弃，外泌体是试管底部的颗粒，将所得沉淀置于-80℃存储。2、血浆外泌体的裂解和总蛋白含量测定采用RIPA法裂解外泌体：取适量外泌体加入200μlRIPA裂解液(含有蛋白酶抑制剂)，震荡器上震荡10s，冰上静置5min，反复震荡、冰浴3次后，4℃12000g离心5min，取上清至另一EP管中，采用BCA法测定其中的蛋白质浓度。使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定外泌体裂解液中总蛋白的浓度，步骤如下：(1)根据样品数量按50倍体积BCA试剂A和1倍体积BCA试剂B均匀混合形成BCA标准工作液，该标准工作液配制后24小时内稳定可用；(2)取10μl蛋白标准品，用PBS液稀释至100μl，使终浓度为0.5mg/ml；(3)按0、1、2、4、8、12、16、20μl加到96孔板的标准品孔中，加PBS液补足至20μl；(4)加适当体积样品至96孔板的样品孔中，加入PBS液补足至20μl；(5)各孔加入200μl的BCA工作液，37℃放置30min；(6)测定562nm处的吸收值，独立重复3次，根据标准曲线计算样品中蛋白质浓度。3、脂肪干细胞的分离和传代培养在无菌条件下，将通过脂肪抽吸手术获得的人源皮下脂肪组织抽取液置入无菌离心管中，以1200rpm离心5min，弃去上清液，并用无菌PBS缓冲液缓慢洗涤、浸泡，再反复使用1200rpm离心3次；将离心后所得脂肪组织置于无菌西林瓶中，等体积加入0.1％Ⅱ型胶原酶并加入双抗后放入37℃恒温水浴箱中消化60min，其间间断轻摇数下，见脂肪组织成细糊状为止；取出，以1200rpm离心5min后，剧烈震荡离心管，然后再以1200rpm离心5min。将离心后的上层油脂及上清液以吸管汲取弃去。加入含血清培养基，以吸管轻轻吹打，制成细胞悬液；再次以1000rpm离心5min后，加入含20％FBS的H-DMEM培养基制成单细胞悬液，用血细胞计数板计数，调整细胞密度为1×106/ml接种于25ml培养瓶中，置于37℃、5％CO2、饱和湿度的细胞培养箱中进行培养，每2到3天换液一次。在倒置相差显微镜下观察细胞生长情况，当细胞增殖达到80％时，弃去培养液，以无菌PBS漂洗1-2次，加入TNE(0.02％EDTA+0.05％胰蛋白酶)1到3ml；将培养瓶置入37℃培养箱消化5min，在倒置相差显微镜下观察细胞形态，见细胞突起收缩、细胞之间间隙明显增大、细胞缩为类圆形，且可见有细胞漂浮时加入含胎牛血清的培养液终止消化。以吸管汲取培养瓶内的液体，轻柔反复吹打培养瓶细胞贴壁面，使全部贴壁细胞脱离，将获得的细胞悬液移入离心管，以1000rpm离心5min，弃上清，加含10％FBS的H-DMEM重悬，用血细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
血浆外泌体在诱导脂肪干细胞分化为膀胱平滑肌细胞中的应用。

【技术特征摘要】
1.血浆外泌体在诱导脂肪干细胞分化为膀胱平滑肌细胞中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述脂肪干细胞为人源脂肪干细胞，所述血浆外泌体为人源血浆外泌体。3.一种诱导脂肪干细胞分化为膀胱平滑肌细胞的方法，其特征在于：其培养基中含有有效量的血浆外泌体。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述培养基为H-DMEM培养基，其中含有有效量的血浆外泌体。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：H-DMEM培养基含10-20％胎牛血清。6.根据权利要求3-5任一所述的方...

【专利技术属性】
技术研发人员：王莉，徐梦龙，
申请(专利权)人：南京盖斯夫医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32