用于菌种保藏的保藏液及重组大肠杆菌高密度发酵方法技术

技术编号:15682697 阅读:207 留言:0更新日期:2017-06-23 13:42
本申请公开了一种用于菌种保藏的保藏液及重组大肠杆菌的高密度发酵方法。本申请的保藏液由缓冲溶液和溶于缓冲溶液的溶质组成,缓冲溶液为pH值6.2-7.0的磷酸盐缓冲液或柠檬酸缓冲液,溶质包括低聚糖、甘油、甘露醇、脱脂奶粉和琼脂糖。本申请的保藏液,能使菌种在0℃-26℃下长期保藏,并保持良好活力,避免传统的-80℃保藏对菌种活力造成影响,为高密度发酵奠定了基础。本申请的重组大肠杆菌的高密度发酵方法,使用本申请的保藏液进行三级菌种保藏,提高了长期菌种保藏过程中的菌体的稳定性,有效的保持了菌种活力,大大降低了发酵过程中由于菌种活力退化导致的生产异常现象,同时,也大大降低了菌种活化等待的时间,随拿随用。

【技术实现步骤摘要】
用于菌种保藏的保藏液及重组大肠杆菌高密度发酵方法
本申请涉及菌种保藏领域,特别是涉及一种用于菌种保藏的保藏液,以及基于该保藏液的重组大肠杆菌的高密度发酵方法。
技术介绍
重组大肠杆菌,是指以大肠杆菌为宿主,导入重组DNA后,能够有效表达外源蛋白的一大类基因工程菌,由于所采用的宿主均为大肠杆菌,因此,统称为重组大肠杆菌。目前重组大肠杆菌主要应用到生物制药领域。在生产过程中发现重组大肠杆菌稳定性不高,在生产过程中,易发生菌种衰退现象,主要原因是,①传统菌种保藏方法,因为冻存于-80℃冰箱中,无法长期保持菌体的活力,菌种的活力衰退易导致菌体自溶、菌体质粒丢失等问题,从而导致目标代谢产物的产量下降;②在发酵过程中,传统发酵方法和补料方法无法达到高菌体密度,使得产品产量的提升受到制约。另外,传统的菌种保藏都需要将菌种保藏在-80℃。重组大肠杆菌的高密度发酵是提高外源表达蛋白产量和质量的一个非常有效的手段,也是目前发酵工程研究的热点和难点。现有研究显示,影响重组大肠杆菌高密度发酵的因素主要包括,宿主菌本身的外源基因表达能力、环境耐受力等,以及培养基、培养条件、补料方法等。
技术实现思路
本申请的目的是提供一种用于菌种保藏的保藏液及重组大肠杆菌高密度发酵方法,旨在有效的保持菌种活力,降低了发酵过程中由于菌种活力退化导致的生产异常现象。为了实现上述目的,本申请采用了以下技术方案:本申请的一方面公开了一种用于菌种保藏的保藏液,该保藏液由缓冲溶液和溶解于缓冲溶液中的溶质组成,缓冲溶液为pH值6.2-7.0的磷酸盐缓冲液或柠檬酸缓冲液,溶质包括低聚糖、甘油、甘露醇、脱脂奶粉和琼脂糖。需要说明的是,采用本申请的保藏液对菌种进行保藏时,可以不用-80℃保藏,直接在0-26℃保存,特别是,对于工作菌种库,但本领域技术人员可以理解,采用本申请的保藏液保存菌种也可以保存于-80℃。在本申请的一种优选方案中,将工作菌种库于4-10℃保藏,一方面降低了保藏成本,另一方面,在4-10℃下,能够更长时间的保持菌体活力,从而为高密度发酵奠定了基础,本申请的一种实现方式中,菌体538天的存活率在74.8%以上。优选的,低聚糖选自海藻糖、蔗糖和麦芽糖中的至少一种。优选的,溶质中包括100重量份的低聚糖,30-40重量份的甘油,50-60重量份的甘露醇,180-200重量份的脱脂奶粉,0.5-0.8重量份的琼脂糖。优选的,保藏液中,缓冲溶液和溶质的重量比为1:8-15。本申请的另一面公开了本申请的保藏液在重组大肠杆菌的菌种保藏中的应用。本申请的另一面还公开了本申请的保藏液在基因工程菌的高密度发酵中的应用。需要说明的是,本申请的保藏液是特别针对重组大肠杆菌的高密度发酵而改良的,可以理解,本申请的保藏液并不仅限用于重组大肠杆菌;其它的基因工程菌,都可以采用本申请的保藏液。本申请的再一面公开了一种重组大肠杆菌的高密度发酵方法,包括采用三级菌种保藏方法建立原始菌种库、主代菌种库和工作菌种库,工作菌种库采用本申请的保藏液,保存于-80℃-26℃,优选的保存于0-26℃;并且,采用工作菌种库的菌种进行高密度发酵,高密度发酵依序包括划线培养、摇床活化培养、种子液培养、种子罐培养和发酵罐培养。需要说明的是,本申请中,三级菌种保藏方法具体包括:①原始菌种库的建立:将构建好的重组大肠杆菌接种于50mL液体培养基中培养6-8h,然后与灭过菌的等量的保藏液充分混匀,无菌条件下分装至100μL安瓿管中,0℃以下低温保存,或者真空冷冻干燥后封口,常温下保存;②主代菌种库的建立:原始菌种库检验合格后,取原始菌种于10mL培养液摇管活化6-8h,然后接种于50mL液体培养基中培养6-8h,再与灭过菌的等量保藏液充分混匀,无菌条件下分装至100μL安瓿管中,0℃以下低温保存,或者真空冷冻干燥后封口,常温下保存;③工作菌种库的建立:主代菌种库检验合格后,取主代菌种于10mL培养液摇管活化6-8h,然后接种于50mL液体培养基中培养6-8h,再与灭过菌的等量的保藏液充分混合,保存于-80℃-26℃。其中,原始菌种库检验和主代菌种库检验都可以参考现有的检验和判断方法,在此不累述;另外,从原始菌种库中取菌液进行活化,以及从主代菌种库取菌液进行活化,都参考现有技术,在此不累述。本申请中常温是指0-26℃。工作菌种库保存于-80℃至26℃,优选的保存于0-26℃,更优选的,保存于4℃-10℃。可以理解,采用本申请的保藏液可以将工作菌种库保存于常温,这样可以方便取用,并且,在常温下也能够更有效的保持菌种活力,但是,采用本申请的保藏液同样可以将菌种保藏于-80℃。还需要说明的是,本申请中,原始菌种库和主代菌种库除了采用保藏液保存于常温以外,也可以将液体培养产物与等量的质量浓度为20%的脱脂奶混匀后,分装、冻干,保存于-80℃;也可以与等量的本申请的保藏液混合,然后保存于-80℃。但是,本申请的优选方案中,原始菌种库、主代菌种库和工作菌种库都是采用本申请的保藏液保存于常温的。可以理解,由于采用本申请的保藏液,能够避免工作菌种库在-80℃的保藏温度下,造成其活力衰退,从而有利于重组大肠杆菌的高密度发酵,至于具体的划线培养、摇床活化培养、种子液培养、种子罐培养和发酵罐培养,可以参考常规的方式进行,在此不累述。只是,本申请的一种优选实现方式中,对发酵罐培养进行了特别优化,以进一步提高发酵密度,这将在以下的方案中详细描述。优选的,工作菌种库采用本申请的保藏液,保存于4℃-10℃。需要说明的是,采用本申请的保藏液,可以使菌种保藏于0℃-26℃,但是,在为了达到更好的保藏效果,优选的,保存于4℃-10℃。可以理解,菌种保藏的作用是,尽量降低或停止菌种的代谢活动,减慢或停止其生长繁殖;因此,温度越低,越利于降低或停止代谢活动和生长繁殖,但是,温度太低,如传统的-80℃保藏,则会影响菌种的活力,特别是长期保存,会使菌种活力衰退;因此,本申请优选的将工作菌种库的菌种保存于4℃-10℃。优选的,发酵罐培养包括,将种子罐培养的菌液接种到发酵罐中进行通气搅拌培养,通气搅拌培养的初始培养条件为,转速100-150rpm,通气量0.9-1.2vvm,温度35-37℃,罐压0.03-0.05MPa;当溶氧低于20%时,提高转速至200-800rpm,提高通气量至1.5-2.5vvm;当发酵OD600至30以上时,加入诱导剂,同时,将发酵罐温度由35-37℃降为25-27℃,继续培养至发酵结束;整个发酵过程中,调节补料速度,pH值保持7.0-7.1;诱导剂为异丙基硫代半乳糖苷。由于采用以上技术方案,本申请的有益效果在于:本申请的保藏液,能使菌种在0℃-26℃下长期保藏,并保持良好的活力,避免传统的-80℃保藏对菌种活力造成影响,为高密度发酵奠定了基础。本申请的重组大肠杆菌的高密度发酵方法,采取三级菌种保藏方法,并使用本申请的保藏液,大大提高了菌种长期保藏过程中的菌体的稳定性;由于菌种保藏于0℃-26℃的温度条件下,更有效的保持了菌种活力,大大降低了发酵过程中由于菌种活力退化导致的生产异常现象,同时,也大大降低了菌种活化等待的时间,随拿随用。具体实施方式现有研究显示,宿主菌、培养基、培养条件、补料方法等都是本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于菌种保藏的保藏液,其特征在于:由缓冲溶液和溶解于缓冲溶液中的溶质组成,所述缓冲溶液为pH值6.2‑7.0的磷酸盐缓冲液或柠檬酸缓冲液,所述溶质包括低聚糖、甘油、甘露醇、脱脂奶粉和琼脂糖。

【技术特征摘要】
1.一种用于菌种保藏的保藏液,其特征在于:由缓冲溶液和溶解于缓冲溶液中的溶质组成,所述缓冲溶液为pH值6.2-7.0的磷酸盐缓冲液或柠檬酸缓冲液,所述溶质包括低聚糖、甘油、甘露醇、脱脂奶粉和琼脂糖。2.根据权利要求1所述的保藏液,其特征在于:所述低聚糖选自海藻糖、蔗糖和麦芽糖中的至少一种。3.根据权利要求1或2所述的保藏液,其特征在于:所述溶质中包括100重量份的低聚糖,30-40重量份的甘油,50-60重量份的甘露醇,180-200重量份的脱脂奶粉,0.5-0.8重量份的琼脂糖。4.根据权利要求1或2所述的保藏液,其特征在于:所述保藏液中,所述缓冲溶液和所述溶质的重量比为1:(8-15)。5.一种如权利要求1-4任一项所述的保藏液在重组大肠杆菌的菌种保藏中的应用。6.一种如权利要求1-4任一项所述的保藏液在基因工程菌的高密度发酵中的应用。7.一种重组大肠杆菌的高密度发酵方法,其特征在于:包括采用三级菌种保藏方法建立原始菌种库、主代菌种库和工作菌种库,所述工作菌种库采用权利要求1-4任一项所述的保藏液,保存于-80℃至26℃,优选的保存于0℃-26℃;并且,采用所...

【专利技术属性】
技术研发人员:熊思驰董宇亮章文蔚陈奥郑越陈波宏许军强杨成功
申请(专利权)人:深圳华大基因研究院
类型:发明
国别省市:广东,44

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