胸膜肺炎放线杆菌的体内诱导抗原及其应用制造技术

技术编号:15680480 阅读:58 留言:0更新日期:2017-06-23 10:00
本发明专利技术公开了胸膜肺炎放线杆菌的体内诱导抗原及其应用。本发明专利技术首先公开了胸膜肺炎放线杆菌的体内诱导抗原,其氨基酸序列如SEQ ID NO:1~6任意一项所示,还公开了前述抗原的制备方法及其用途,以及采用其制备的疫苗。本发明专利技术6种体内诱导抗原可以有效促进淋巴细胞增殖,刺激机体产生胸膜肺炎放线杆菌特异性抗体以及γ‑干扰素、IL‑4等细胞因子,保护性强,并且稳定性强,安全性好,临床应用前景优良。

In vivo antigen of Actinobacillus pleuropneumoniae and its use

The invention discloses an antigen of Actinobacillus pleuropneumoniae in vivo and uses thereof. In vivo induced antigen first the invention discloses Actinobacillus pleuropneumoniae, the amino acid sequence of SEQ ID NO:1 ~ 6 any one shown, also discloses the antigen preparation method and application thereof, and the use of the preparation of the vaccine. The invention of 6 kinds of in vivo induced antigen can effectively promote lymphocyte proliferation, induce Actinobacillus pleuropneumoniae specific antibody and interferon gamma, IL 4 cytokines, protective, and strong stability, good safety, good prospects for clinical application.

【技术实现步骤摘要】
胸膜肺炎放线杆菌的体内诱导抗原及其应用
本专利技术涉及胸膜肺炎放线杆菌的体内诱导抗原及其应用。
技术介绍
猪传染性胸膜肺炎是危害养猪业的重要呼吸系统疾病之一,其病原为胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae)。该病通过呼吸系统相互传播,引起猪纤维素性胸膜炎和出血性肺炎。胸膜肺炎放线杆菌在1957年从猪肺脏中分离出,是猪的一种重要的呼吸系统病原微生物。APP引起猪的传染性胸膜肺炎(PCP),该病给世界养猪业带来严重危害。研究发现,对于猪肺炎的治疗导致病原菌耐药性的不断提高。抗菌剂作为促生长剂的日常使用也增强了病原菌的耐药性。抗生素的残留及病原菌耐药性的增强引起养殖业成本增加,逐渐引起人们的重视。APP商品灭活疫苗已被广泛用于PCP的防控。此外,APP的一些重组抗原被证明为免疫保护抗原。当前使用的大部分商品疫苗为传统的灭活菌苗,这些疫苗能提供部分免疫保护,能降低死亡率,但并不能降低发病率。在一个国家或地区,有多个流行血清型流行,同时有几个优势血清型,灭活疫苗通常来源于一个或几个优势血清。因为不同血清型间缺乏有效的交叉保护,使用商品灭活菌苗很难有效控制PCP。研究发现APP的一些保守的毒力因子(如apx毒素),作为疫苗候选因子可以提供一定的交叉保护。但是要制备得到保护效果比较好的重组毒力蛋白却并非易事。
技术实现思路
为了解决上述问题,本专利技术提供了新的胸膜肺炎放线杆菌的体内诱导抗原及其应用。本专利技术胸膜肺炎放线杆菌的体内诱导抗原,其氨基酸序列如SEQIDNO:1~6任意一项所示。本专利技术表达前述抗原的基因片段,其核苷酸序列如SEQIDNO:7~12任意一项所示。本专利技术一种重组载体,它包括前述的基因片段;所述重组载体优选为pET-28a载体。本专利技术一种重组菌,它包括前述的载体;所述重组菌有选为重组大肠杆菌。本专利技术一种制备前述抗原的方法,步骤如下:取前述的重组菌,诱导表达,纯化,即可。本专利技术前述抗原在制备预防猪传染性胸膜肺炎的疫苗中的用途。本专利技术一种疫苗,它包含前述抗原以及药学上可接受的辅料或者载体制备而成。其中,所述的辅料或者载体为免疫佐剂和/或防腐剂。其中,所述佐剂为弗氏佐剂,优选为弗氏完全佐剂。本专利技术还提供了前述的疫苗在制备预防猪传染性胸膜肺炎的药物中的用途。其中,所述的预防药物是注射制剂。本专利技术6种体内诱导抗原可以有效促进淋巴细胞增殖,刺激机体产生胸膜肺炎放线杆菌特异性抗体以及γ-干扰素、IL-4等细胞因子,保护性强,并且稳定性强,安全性好,临床应用前景优良。以下通过实施例形式的具体实施方式,对本专利技术的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本专利技术上述内容所实现的技术均属于本专利技术的范围。附图说明图1运用生物信息学方法对体内诱导抗原表位的预测。图2重组菌株未诱导(A)和诱导(B)的SDS-PAGE分析。图3纯化蛋白的SDS-PAGE和Westernblotting。A.6个纯化重组蛋白的SDS-PAGE。B.6个重组蛋白的westernblot分析。LaneM:proteinmarker.Lane1-6:RnhB,GalU,GalT,APL_1061,APL_1166,HflX。图4IgG水平检测。采集免疫组和对照组未免疫和二免后两周的血清,分析IgG水平。运用由相应重组蛋白包被的间接ELISA方法检测IgG水平。抗体水平用450nm吸光值表示。图5淋巴细胞增值实验。分离免疫组和对照组二免后两周的脾细胞,用相应重组蛋白和conA刺激培养细胞。用MTT法检测淋巴细胞的增殖水平,检测结果以595nm吸光值表示。图6淋巴细胞亚群分析。用流式细胞术分析小鼠脾细胞CD3+,CD3+CD4+和CD3+CD8+T-cell亚群的水平。图7运用夹心ELISA方法检测脾细胞IFN-γ(A),IL-2(B)和IL-4(C)的分泌水平。图8肺脏组织病理分析。采集各实验组小鼠肺脏、固定并进行组织病理学分析。A:正常对照,B:阴性对照,C-H:分别RnhB,GalU,GalT,APL_1061,APL_1166和HflX免疫组。H&E染色,400×放大。(A)正常对照。(B)阴性对照小鼠肺组织表现为血管和支气管周围炎性细胞浸润。(C)rRnhB表现为轻微的炎性细胞浸润。(D)免疫组存活小鼠肺组织的炎性细胞浸润明显减少。图9免疫组织化学分析A:巨噬细胞的免疫组化分析。B:中性粒细胞的免疫组化分析。a:正常对照,b:阴性对照,c-h:分别为免疫RnhB,GalU,GalT,APL_1061,APL_1166andHflX组,i:炎性细胞统计分析。图10APPL20株攻毒后小鼠的生存曲线。图11pET-28a质粒图谱。具体实施方式实施例1本专利技术诱导抗原的制备及其效果验证1、实验材料和方法1.1菌株,质粒和培养条件大肠杆菌DH5a,BL21(DE3)购自北京天根公司,APPL20株及其他血清型参考菌株均由本实验保存。大肠杆菌在LB(Luria-Bert)液体或固体培养基中培养,根据需要加入终浓度100μg/ml的卡那霉素(Amp),所有细菌均在37℃静止(固体)或振摇(液体)培养。表1.IVI基因筛选结果pET-28a质粒图谱如图11所示。1.2工具酶和试剂各种限制性内切酶(BamHⅠ,HandⅢ,NotⅠ等)、Primerstar聚合酶、T4DNA连接酶等工具酶、DNAMarker均购于宝生物工程(大连)有限公司。DNA回收试剂盒购于天根公司。胰蛋白大豆琼脂(TrypticSoyAgar,TSA)、胰蛋白大豆肉汤(TrypticSoyBroth,TSB)粉剂购自西班牙Difco公司。HRP标记的羊抗鼠IgG二抗购自southernbiotech公司。无支原体新生牛血清购自杭州四季青有限公司,使用前经56℃灭活30min。IPTG异丙醇-β-D-硫代半乳糖苷溶液(RT108-01)、氨苄青霉素(Ampicillin,Amp)、卡那霉素(kanamycin,Kan)、蛋白上样Buffer购自天根公司。NAD、溶菌酶、蛋白酶K均购自美国Invitrogen公司。SDS-PAGE凝胶配制试剂盒,westernblot显色底物均购于碧云天生物技术公司。1.3培养基及抗生素的配制TSB(TrypticSoyBroth)液体培养基:6gTSB粉末溶于180mL水中,121℃高压蒸气灭菌20min。使用时加入终溶度为10μg/mL的NAD和10%小牛血清。TSA(TrypticSoyAgar)固体培养基:8gTSA粉末溶于180mL水中,121℃高压蒸气灭菌30min,待温度降至约50℃时加入终溶度为10μg/mL的NAD和10%小牛血清,铺制平板,待培养基凝固后,于4℃保存备用。LB液体培养基:胰蛋白胨10g,酵母浸出物5g,NaCl10g,溶于ddH2O中,完全溶解后用5mol/LNaOH调pH值至7.0~7.2,定容至1000mL,121℃高压蒸气灭菌20min,室温保存。LB固体培养基:在LB液体培养基中加入1.5%的琼脂粉,121℃高压蒸气灭菌20min,待培养基温度降至50℃左右,加入相应的抗生素后,铺制平板,待培养基凝固后,于4℃保存备用。氨本文档来自技高网...
胸膜肺炎放线杆菌的体内诱导抗原及其应用

【技术保护点】
胸膜肺炎放线杆菌的体内诱导抗原,其特征在于:其氨基酸序列如SEQ ID NO:1~6任意一项所示。

【技术特征摘要】
2016.09.14 CN 201610825560X1.胸膜肺炎放线杆菌的体内诱导抗原,其特征在于:其氨基酸序列如SEQIDNO:1~6任意一项所示。2.表达权利要求1所述抗原的基因片段,其特征在于:其核苷酸序列如SEQIDNO:7~12任意一项所示。3.一种重组载体,其特征在于:它包括权利要求2所述的基因片段;所述重组载体优选为pET-28a载体。4.一种重组菌,其特征在于:它包括权利要求3所述的载体;所述重组菌有选为重组大肠杆菌。5.一种制备权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员:曹三杰张飞文心田杨宇生祝壮赵勤黄小波伍锐文翼平马晓平
申请(专利权)人:四川农业大学
类型:发明
国别省市:四川,51

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