一种母乳寡糖的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种母乳寡糖的制备方法。母乳样品经过低温离心脱脂，加入有机溶剂沉淀除蛋白后，再经液相色谱方法进行分离，以极性填料为色谱柱固定相，流动相为水和有机溶剂，或缓冲盐水溶液和有机溶剂，使用等度，或梯度方法进行洗脱，收集除乳糖外的寡糖馏分，即获得母乳寡糖。该方法具有选择性好，分离效率高，稳定性好，操作简便可控等特点，适用于放大制备。

Preparation method of mother milk oligosaccharide

The invention relates to a preparation method of human milk oligosaccharides. Breast milk samples after centrifugation after addition of defatted protein, organic solvent precipitation, followed by liquid chromatography method for separation, with the polar filler as the stationary phase, the mobile phase was water and organic solvent or aqueous buffer and organic solvents, etc., or by gradient elution, collecting except lactose the oligosaccharide fraction, obtain oligosaccharide. The method has the advantages of good selectivity, high separation efficiency, good stability, simple and controllable operation, and the like, and is suitable for amplification and preparation.

【技术实现步骤摘要】
一种母乳寡糖的制备方法
本专利技术涉及一种母乳寡糖的制备方法。其特征是：样品经过低温离心脱脂，加入有机溶剂沉淀除蛋白，再经过柱色谱分离除乳糖，获得寡糖样品。该方法具有选择性好，分离效率高，稳定性好，操作简便可控等特点，适用于放大制备。
技术介绍
糖类化合物被认为是能量的来源，生物结构的重要组成部分，同时具有多种生物功能。根据聚合度不同，糖类物质可分为单糖、寡糖和多糖。大多数哺乳动物(人、牛和羊等)的乳汁中都含有种类繁多的寡糖，具有独特的生理功能。如人乳中的寡糖不仅结构复杂，种类繁多，而且含量丰富，是人乳中重要的活性因子[LebrillaCB.etal.,J.ProteomeRes.,2010,9(8),4138-4151]。天然的人乳寡糖对于婴儿的神经系统发育[BorsigL.etal.,SwissMed.Wkly.,2014,144(w13927),1-9]，预防感染[NewburgDS.etal.,JMammaryGlandBiolNeoplasia.,1996,1(3):271-283]和促进正常的肠道微生物生态形成[KunzC.etal.,Actapediatr.,1993,82(11):903-912]等非常重要，是保证婴儿健康成长的关键因素，同时还具有增强人体免疫力，预防癌症发生[GallaherDDJKhil.etal.,JNutr,1999,129(Suppl7):1483-1487]等功能。深入了解母乳寡糖生物和药理活性的前提是得到寡糖样品，因此，以获得高纯度的寡糖为目标的寡糖制备技术就成为了寡糖研究中的关键步骤之一。然而，由于寡糖为极性的化合物，含有不同空间构型的单糖结构、不同的糖基序列、以及不同的糖置换方式，其可产生多样的结构种类，从而增加了分离的难度。近年来，对母乳寡糖制备的研究备受关注。目前，对母乳寡糖分离纯化主要有3种策略：(1)直接根据分子量的大小或所带电荷的多少，采用凝胶渗透色谱或高效阴离子交换色谱进行分离[EggeH.etal.,J.Chromatogr.B,1996,685,211-221；SawatzkiG.etal.,Anal.Chem.,1999,71(17),3755-3762]；(2)对天然母乳寡糖进行衍生化修饰后，再利用反相或正相色谱进行分离[LebrillaCB.etal.,Anal.chem.,2012,430,97-104]；(3)通过化学方法、酶促方法、化学-酶促方法，合成母乳寡糖[WongCH.etal.,JAmChemSoc1999,121,734-753；BoomRM.etal.,BiotechnolProg，2003,19,1391]。由于母乳寡糖异构体较多，策略1的选择性较低，时间周期长，制备效率低。策略2虽然具有一定的选择性，但得到的寡糖为衍生物形式，破坏了天然母乳寡糖的原始结构。策略3，化学方法面临糖基供体存在电子、空间的阻碍，使其较难形成糖苷键，同时在反应过程中还存在立体化学消旋产生的副产物等缺点。酶促反应中，糖基转移酶以及糖苷酶的来源以及活性底物受到一定的限制。因此，本专利技术设计出一种新的母乳寡糖制备方法用于寡糖的粗分离。该方法选择性好，制备效率高，稳定性好，易于放大制备。
技术实现思路
本专利技术涉及一种母乳寡糖的制备方法。本专利技术特征在于：样品经过离心脱脂、沉淀除蛋白、柱色谱除乳糖，获得寡糖样品。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：一种母乳寡糖制备方法，样品经过离心脱脂，加入有机溶剂沉淀除蛋白后，再经液相色谱方法进行分离，以极性填料为色谱柱固定相，流动相为有机溶剂和水，或有机溶剂和缓冲盐水溶液，通过优化色谱参数，使用等度，或梯度洗脱条件。收集馏分，既得寡糖样品。所述离心脱脂步骤为：取母乳样品，于0-10℃条件下，500-50000g离心5-500分钟，除去上层脂层。重复离心和除去上层脂层0-5次后，取下层，即得脱脂母乳样品。所述沉淀除蛋白步骤为：取脱脂母乳样品，加入1-5倍体积量的有机溶剂后混匀，于0-10℃静置2-48小时后，0-10℃500-50000g离心5-500分钟，收集上层液，重复离心和收集上层液0-5次后蒸干，得到脱脂除蛋白样品。所使用的有机溶剂有甲醇、乙腈、乙醇和丙酮中的一种或几种。所述固定相为极性色谱填料，包括硅胶或极性键合硅胶填料，其结构式如下：其中SiO2为硅胶，R为极性基团，有二醇基、酰胺、氨基、羧基、糖基和两性离子等中的一种或几种。所述洗脱液中的有机溶剂为甲醇、乙腈、乙醇和丙酮中的一种或几种。所述缓冲盐类型及其于流动相中的浓度及pH如下之一：a)甲酸铵缓冲盐，浓度0-200mM，pH2.0-7.0；b)乙酸铵缓冲盐，浓度0-200mM，pH2.0-7.0；c)碳酸氢铵缓冲盐，浓度0-200mM，pH6.0-9.0；优化流动相梯度如下：使用等度方法进行洗脱：流动相中水或缓冲盐水溶液与有机溶剂按体积比例为5/95～95/5作为洗脱液；或使用线性梯度方法进行洗脱：流动相中水或缓冲盐水溶液的体积浓度从小到大变化，起始体积浓度为5-60％，终止体积浓度为40-95％；或使用台阶梯度方法进行洗脱：按流动相中水或缓冲盐水溶液的体积比例从5％～95％中从小至大随机选取2个以上进行洗脱操作。将乳糖控制在大于1至小于3倍的柱体积内流出，收集在0-1倍柱体积和在3-40倍柱体积的流出液、或收集在3-40倍柱体积的流出液，即为所需馏分。优化色谱操作参数如下：色谱柱内径4.6-500mm；样品浓度为0.1-500mg/mL；固体载样量为0.01％-15％；流速为0.1-2倍柱体积/min；柱温为15-60℃；检测器为UV，检测波长为190-280nm。本专利技术具有如下优点：1.选择性高。针对当前寡糖制备遇到的问题，本专利技术提出使用极性色谱填料作为固定相，寡糖与乳糖可以获得较好的分离，制备效率高。2.制备条件简单。样品无需衍生化，保留了寡糖的原始结构。3.重复性好。本专利技术中使用的色谱柱固定相具有很好的稳定性，易于放大制备。附图说明图1为实施例1母乳寡糖制备谱图；图2为实施例1寡糖各个馏分分析叠加图谱。具体实施方式实施例1：人乳寡糖的脱脂除蛋白过程取1mL人乳，于4℃下4000g离心60min，除去上层脂质。取下层水层，加入2倍体积量的无水乙醇混匀，于4℃静置12小时后，4℃4000g离心60min，收集上层液，蒸干，即得脱脂除蛋白寡糖样品。人乳寡糖的制备称取脱脂除蛋白寡糖样品，配置成浓度为10mg/mL的溶液，进样量为100L，使用酰胺柱，色谱柱内径4.6mm；流速为1.0mL/min；柱温为30℃。流动相A为乙腈，B为水，C为100mM甲酸铵。乙腈为弱洗脱溶剂，梯度条件洗脱，洗脱条件为：0-30min，85％-50％A，C％保持10％不变。按时间收集10-30min馏分，即得脱脂除蛋白除乳糖的寡糖样品9.2mg，并进行色谱和质谱检测确认其为纯的寡糖混合物。实施例2：人乳寡糖的脱脂除蛋白过程取10mL人乳，于10℃下10000g离心30min，除去上层脂质。重复离心和除去上层脂层2次后，取下层水层，加入3倍体积量的乙腈混匀，于10℃静置2小时后，10℃10000g离心30min，上层液重复离心和收集上层液3次后，蒸干，即本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种母乳寡糖的制备方法，其特征是：母乳样品经过低温离心脱脂，加入有机溶剂沉淀除蛋白后，柱色谱除乳糖，获得母乳寡糖；柱色谱除乳糖步骤为：取脱脂除蛋白样品，采用体积浓度20‑80％有机溶剂水溶液溶解样品，样品经液相色谱进行分离，以极性填料为色谱柱固定相；流动相为水和有机溶剂，或缓冲盐水溶液和有机溶剂；使用等度，或梯度方法进行洗脱，收集除乳糖外的寡糖馏分。

【技术特征摘要】
1.一种母乳寡糖的制备方法，其特征是：母乳样品经过低温离心脱脂，加入有机溶剂沉淀除蛋白后，柱色谱除乳糖，获得母乳寡糖；柱色谱除乳糖步骤为：取脱脂除蛋白样品，采用体积浓度20-80％有机溶剂水溶液溶解样品，样品经液相色谱进行分离，以极性填料为色谱柱固定相；流动相为水和有机溶剂，或缓冲盐水溶液和有机溶剂；使用等度，或梯度方法进行洗脱，收集除乳糖外的寡糖馏分。2.按照权利要求1所述的制备方法，其特征是：离心脱脂步骤为：取母乳样品，于0-10℃条件下，500-50000g离心5-500分钟，除去上层脂层；重复离心和除去上层脂层0-5次后，取下层，即得脱脂母乳样品。3.按照权利要求1所述的制备方法，其特征是：沉淀除蛋白步骤为：取脱脂母乳样品，加入1-5倍体积量的有机溶剂到脱脂母乳样品中，混匀，于0-10℃静置2-48小时后，0-10℃500-50000g离心5-500分钟，收集上层液，重复离心和收集上层液0-5次后，上层液蒸干，得到脱脂除蛋白样品；有机溶剂有乙醇、丙酮、甲醇、乙腈中的一种或二种以上。4.按照权利要求1所述的制备方法，其特征是：柱色谱除乳糖过程样品溶解液中有机溶剂甲醇、乙腈、乙醇、丙酮中的一种或二种以上；样品浓度为0.1-500mg/mL；柱色谱除乳糖过程洗脱液中的有机溶剂有：甲醇，乙腈，乙醇，异丙醇，丙酮中的一种或二种以上。5.按照权利要求1所述的制备方法，其特征是：极性填料为硅胶或硅胶表面键合极性基团的填料，所键合的极性基团有二醇基、酰胺、氨基、羧基、糖基和两性离子等中的一种或二种...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁鑫淼，丁俊杰，金戈辉，郑鹏宇，闫竞宇，郭志谋，沈爱金，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁,21