本发明专利技术涉及一种通过光调控精确检测线粒体内H2S2的荧光探针及其制备方法和应用，属于有机荧光探针领域。H2S是继NO与CO之后的第三个被确认的人体气体信号分子，而在ROS的作用下，H2S会转化为H2S2，所以H2S2荧光探针具有十分重要的意义。Mito‑H2S2荧光探针的结构式如(Ⅰ)所示。本发明专利技术荧光探针能够精确检测线粒体内的H2S2而避免细胞质内的H2S2的干扰，另外，该探针具有较好的线粒体靶向性、化学稳定性、生物兼容性和选择性等特点。激光共聚焦成像实验表明该探针具有较好的细胞通透性，对细胞和生物体无毒副作用,可以实现亚细胞水平活性氧水平的检测，并进一步应用于神经退行性疾病及癌症的研究。
An accurate detection of H in mitochondria by light regulation
The present invention relates to an accurate detection of H in mitochondria by light regulation
【技术实现步骤摘要】
一种通过光调控精确检测线粒体内H2S2的荧光探针及其制备方法和应用
本专利技术涉及一种通过光调控精确检测线粒体内H2S2的荧光探针及其制备方法和应用，属于有机荧光探针领域。
技术介绍
硫化氢是继NO与CO之后的第三个被确认的人体气体信号分子，在神经信号传导过程中起着十分重要的调节作用。同时硫化氢还被发现在心血管系统中也具有许多重要的生理功能，如调节血管平滑肌的舒张、抗氧化、抑制发炎、降低新陈代谢速率等。硫化氢水平异常还被认为与阿尔兹海默氏症、唐氏综合症、糖尿病和肝硬化等密切相关。硫化氢的生理学和病理学功能研究已经成为目前化学与生物学研究的热点，而发展准确快捷的硫化氢检测方法成为该领域的关键课题之一。由于硫化氢的pKa1约为7.04，在生理(pH7.40)条件下硫化氢会发生脱质子解离作用，胞内H2S与HS-的比例约为1∶2(nH2S∶nHS-)。因此文献中常以NaHS或Na2S作为H2S供体进行探针响应性能的研究,本文也同样使用Na2S2作为H2S2供体进行探针响应性能的研究。线粒体在生命中的重要角色，促使它一直作为科学研究中的重中之重。在线粒体的研究中，多以荧光探针主，一个理想的荧光探针是无数个科学家的梦想，至今已经报道出来了很多荧光探针，如检测活性氧簇、活性氮簇、金属离子，生物小分子等的荧光探针，但是这些荧光探针都存在一个致命的缺点就是在经过细胞质靶向线粒体的过程中不能避免来自细胞质内的被检测物的干扰，造成研究结果缺乏说服力。为了解决这一存在已久的问题，急需研发一种可以定位线粒体又能避免细胞质内被检测物的荧光探针。
技术实现思路
本专利技术解决的技术问题是：提出一种可定位活细胞中线粒体，并通过光调控精确检测线粒体内H2S2的荧光探针及其制备方法和应用。为了解决上述技术问题，本专利技术提出的技术方案是：一种通过光调控精确检测线粒体内H2S2的荧光探针，其特征在于，所述的荧光探针为Mito-H2S2荧光探针，Mito-H2S2荧光探针的结构式如(Ⅰ)所示：为了解决上述技术问题，本专利技术提出的技术方案是：所述的通过光调控精确检测线粒体内的H2S2荧光探针的制备方法所述的Mito-H2S2荧光探针的制备方法包括如下步骤：将荧光素衍生化合物和4-叠氮丁基三苯基膦依次加入到乙腈中，常温搅拌8-12h，冷却抽滤，除去溶剂，经硅胶柱层析提纯得到目标产物Mito-H2S2荧光探针，反应式如下：优选的，所述荧光素衍生化合物和4-叠氮丁基三苯基膦的摩尔比值为0.8-1:1。优选的，所述的荧光素衍生物的制备方法如下：(1)将荧光素溶解在N,N-二甲基甲酰胺DMF中，然后加入K2CO3和溴丙基炔，其中溴丙基炔有80％的体积比在甲苯中，溴丙基炔然后在60℃下搅拌1-3h，用水冲淡反应混合物，然后萃取旋干，经过胶柱层析提纯得到荧光素单溴丙炔，(2)在冰浴中将1-乙基-3(3-二甲基丙胺)碳二亚胺EDCI加入二氯甲烷中，然后加入光保护基团和4-二甲氨基吡啶DMAP搅拌10-30min，荧光素单溴丙炔最后加入，搅拌20-28h，然后过滤，用二氯甲烷冲洗，滤液被选干，然后经硅胶柱层析提纯得到光保护荧光素单溴丙炔。优选的，所述步骤(1)中荧光素与溴丙基炔的摩尔比值为1:1-1.2，溴丙基炔不能过多，会产生过多杂点。优选的，所述步骤(2)中荧光素单溴丙炔、光保护基团的摩尔比为1:1-1.3，其中注意光保护基团的羧基注意活化，有利于光保护荧光素单溴丙炔的产率。为了解决上述技术问题，本专利技术提出的技术方案是：所述的通过光调控精确检测线粒体内H2S2荧光探针的应用，所述的荧光探针可应用于生理体系中精确检测线粒体内的H2S2。本专利技术的有益效果：本专利技术的荧光探针具有较好的线粒体靶向性、化学稳定性、生物兼容性和H2S2选择性。激光共聚焦成像实验表明该探针具有较好的细胞通透性，对细胞和生物体无毒副作用。本专利技术的荧光探针在可应用于细胞体系中通过光调控精确检测线粒体内的H2S2而避免来自细胞质中H2S2的干扰的应用。本专利技术的精确测线粒体内H2S2的荧光探针可用于活细胞线粒体H2S2的精确检测，主要用的活细胞为Hela细胞株。激光共聚焦成像实验表明该探针具有较好的细胞通透性，对细胞和生物体无毒副作用,可以实现亚细胞水平活性氧水平的检测，并进一步应用于神经退行性疾病及癌症的研究。附图说明下面结合附图对本专利技术的作进一步说明。图1是实施例1制备的Mito-H2S2(10uM)在UV光照150秒后对40um的Na2S2浓度的PBS的缓冲溶液的不同响应时间的荧光光谱图。图2是实施例1制备的Mito-H2S2(10uM)光照150秒后对100um的各种离子的PBS的缓冲溶液的响应的荧光光谱图。图3是实施例1制备的Mito-H2S2(10uM)在细胞线粒体中的共聚焦显微成像。具体实施方式实施例1通过光调控精确检测线粒体内H2S2的荧光探针的制备方法如下：(1)将0.8g荧光素溶解在N,N-二甲基甲酰胺DMF中，然后加入0.93g的K2CO3和0.18ml的溴丙基炔，其中溴丙基炔有80％的体积比在甲苯中，然后在60℃下搅拌1h，用水冲淡反应混合物，然后萃取旋干，经硅胶柱层析提纯得到荧光素单溴丙炔。1HNMR(300MHz,CDCl3):δ10.14(s,1H),8.02(t,J＝6Hz,1H),7.82(t,J＝7.5Hz,1H),7.75(t,J＝7.5Hz,1H),7.30(d,J＝6Hz,1H),7.01(d,J＝3Hz,1H),6.74(m,3H)6.58(s,1H),4.89(d,J＝1.5Hz,2H),3.62(d,J＝1.5Hz,1H)。(2)在冰浴中将106mg的N,N-二甲基甲酰胺EDCI加入10ml的二氯甲烷中，然后加入193.9mg的光保护基团和7mg的4-二甲氨基吡啶DMAP搅拌10min，250mg的荧光素单溴丙炔最后加入搅拌22h，然后过滤，用二氯甲烷冲洗，滤液被选干，然后经硅胶柱层析提纯得到光保护荧光素单溴丙炔。1HNMR(300MHz,CDCl3):δ8.07(t,J＝7.5Hz,2H),7.96(d,J＝4.5Hz,1H),7.71(dd,J1＝3.8Hz,J2＝7.5Hz,2H),7.59(t,J＝7.9Hz,1H),7.35(m,5H),7.19(d,J＝7.2Hz,1H),7.10(s,1H),6.89(s,1H),6.80(s,2H),6.76(t,J＝5.7Hz,2H),5.07(s,2H),4.74(s,2H),4.84(s,2H),3.65(d,J＝1.5Hz,1H)。(3)将71.11mg的荧光素衍生化合物和50mg的4-叠氮丁基三苯基膦依次加入到3ml的乙腈中，常温搅拌8小时，冷却抽滤，除去溶剂，经硅胶柱层析提纯得到目标产物Mito-H2S2荧光探针，1HNMR(300MHz,CDCl3):δ8.25(t,J＝4.5Hz,2H),8.16(d,J＝4.5Hz,1H),8.07(d,J＝4.5Hz,1H),7.90(m,3H),7.84(m,14H),7.36(t,J＝1.8Hz,2H),7.31(dd,J1＝4.5Hz,J2＝3.9Hz,3H),7.26(t,J＝4.0Hz,3H),7.15(d,J＝1.5Hz,1H),7.07本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种通过光调控精确检测线粒体内H
【技术特征摘要】
1.一种通过光调控精确检测线粒体内H2S2的荧光探针，其特征在于，所述的荧光探针为Mito-H2S2荧光探针，Mito-H2S2荧光探针的结构式如(Ⅰ)所示：2.一种如权利要求1所述的通过光调控精确检测线粒体内的H2S2荧光探针的制备方法，其特征在于，所述的Mito-H2S2荧光探针的制备方法包括如下步骤：将荧光素衍生化合物和4-叠氮丁基三苯基膦依次加入到乙腈中，常温搅拌8-12h，冷却抽滤，除去溶剂，经硅胶柱层析提纯得到目标产物Mito-H2S2荧光探针，反应式如下：3.根据权利要求2所述的通过光调控精确检测线粒体内H2S2荧光探针的制备方法，其特征在于，所述荧光素衍生化合物和4-叠氮丁基三苯基膦的摩尔比为0.8-1:1。4.根据权利要求2所述的通过光调控精确检测线粒体内H2S2荧光探针的制备方法，其特征在于，所述的荧光素衍生物的制备方法如下：(1)将荧光素溶解在N,N-二甲基甲酰胺DMF中，然后加入K2CO3和溴丙基炔，其中溴丙基炔有8...
【专利技术属性】
技术研发人员：张承武，李林，韩林奇，王刘林，慈乔乔，仇兴汉，王彦滨，黄维，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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