一种血小板及含有血小板的制剂的制备方法技术

本发明专利技术提供了一种血小板及含有血小板的制剂的制备方法，属于血液成分分离领域。该制备方法包括：将抗凝全血样品进行第一次离心得到上层液；再对上层液进行过滤处理以去除上层液中的白细胞，得到滤液；随后对滤液进行第二次离心，保留沉淀。该方法能够有效的去除血小板中混有的白细胞，且能够有效避免血小板的损失，从而提高所制得的血小板的纯度和回收率。通过这种方法所得到的血小板的纯度高达95％以上，且血小板的回收率高达80％以上。此外，这种方法的工艺步骤简单，所使用的试剂及设备均容易得到且价格低廉，因此其制备高纯度的血小板的成本低、周期短。

Preparation method of platelet and preparation containing platelet

The invention provides a preparation method of platelet and preparation containing platelet, belonging to the field of blood component separation. The preparation method comprises the following steps: anticoagulated whole blood sample for the first time to get the upper centrifugal liquid; the upper liquid was filtered to remove the upper liquid of white blood cells, then get filtrate; second times of centrifugal filtrate, retain precipitation. The method can effectively remove the mixed white blood cells in the platelets, and can effectively avoid the loss of platelets, thereby improving the purity and the recovery rate of the prepared platelets. By this method, the purity of the obtained platelet is higher than 95%, and the recovery rate of the platelet is more than 80%. In addition, the process is simple, the reagents and equipment used are easy to obtain and the price is low, so the preparation of high-purity platelets has low cost and short cycle.

【技术实现步骤摘要】
一种血小板及含有血小板的制剂的制备方法
本专利技术涉及血液成分分离领域，具体而言，涉及一种血小板及含有血小板的制剂的制备方法。
技术介绍
血小板，是哺乳动物中的有形成分之一，是从骨髓成熟的巨核细胞胞质裂解脱落下来的具有生物活性的小块胞质。血小板的体积小，无细胞核，呈双面微凹的圆盘状，直径为2-3微米。血小板具有特定的形态结构和生化组成，其在止血、伤口愈合、炎症反应、血栓形成及器官移植排斥等生理和病理过程中有重要作用。现有的血小板制备方法主要有：洗涤法、梯度密度离心法、凝胶过滤法、免疫磁珠分选技术、以及流式细胞术。这些方法都各有优劣，比如洗涤法和梯度密度离心法，适用于少量血液中血小板的分离纯化，但血小板的纯度和回收率都会相对偏低；凝胶过滤法也是适用于少量血液中血小板的分离纯化，虽然其能提高血小板的纯度，但其操作复杂、分离难度大；同时，免疫磁珠分选技术，虽然该方法得到的血小板的回收率和纯度均较高，但该方法所用的磁珠以及抗体的价格高昂，导致分离纯化的成本高；而采用流式细胞仪，一次上机全血至少是400mL，不适用少量全血中血小板的分离，且费用昂贵、整个分离流程所需时间较长。因此，目前急需一种成本低廉且能够大幅提高血小板的纯度及回收率的血小板的制备方法。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种血小板的制备方法，这种制备方法能够有效的去除血小板中混有的白细胞，且能够有效避免血小板的损失，从而提高所制得的血小板的纯度和回收率。本专利技术的第二目的在于提供一种含有血小板的制剂的制备方法，由这种制备方法制得的制剂中，血小板的纯度高，且其中不含白细胞，使用安全性高。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：一种血小板的制备方法，其包括：将抗凝全血样品进行第一次离心得到上层液；再对上层液进行过滤处理以去除上层液中的白细胞，得到滤液；随后对滤液进行第二次离心，保留沉淀。一种含有血小板的制剂的制备方法，该血小板是通过上述方法制备得到。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：本专利技术提供的血小板的制备方法，适用于较少量的全血中(低至1ml)的血小板的分离，通过这种方法能够有效的去除血小板中混有的白细胞，且能够有效避免血小板的损失，从而提高所制得的血小板的纯度和回收率，在本专利技术中，通过这种方法所得到的血小板的纯度高达95％以上，且血小板的回收率高达80％以上。此外，这种方法的工艺步骤简单，所使用的试剂及设备均容易得到且价格低廉，因此其制备高纯度的血小板的成本低、周期短。具体实施方式下面将结合实施例对本专利技术的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限制本专利技术的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。目前，从全血中分离血小板的技术主要有：洗涤法、梯度密度离心法、凝胶过滤法、流式细胞仪、以及免疫磁珠分选技术。但是对于如何在较低成本下从较少量的全血中分离得到高纯度(至少大于90％)的血小板，上述技术均无法实现。这主要是因为：流式细胞仪对上机血量有要求(至少大于400mL)，因此不适用于少量全血的分离；免疫磁珠分选技术虽然能够得到高纯度及高回收率的血小板，然而磁珠及抗体的价格高昂，导致分离纯化的成本偏高，不实用；而洗涤法、梯度密度离心法、凝胶过滤，这3种方法是根据血小板的物理属性进行分离，不能有效去除白细胞，且血小板损失量较大，使得最后所得到的血小板的纯度及回收率均偏低。鉴于此，本实施方式提供一种血小板的制备方法，其包括：S1:将抗凝全血样品进行第一次离心后，得到上层液。抗凝全血样品是通过将新鲜采集的全血样品与抗凝剂混合制得。例如，进一步的，抗凝全血样品可以是通过用含抗凝剂的采血管采集静脉血得到，比如用枸橼酸钠抗凝管采集静脉血。为了使血小板的分离纯化效果更佳，在本专利技术中，选用较少量的抗凝全血样品，比如选用体积为10～15mL的抗凝全血样品。通常在采血后，在室温下运输采集的全血样品，尽量避免剧烈震荡，并尽可能在较短的时间内进行血小板的分离，以得到较高的回收率。抗凝全血样品在第一次离心后，血液分为三层，下层呈暗红色，主要为质量较大的红细胞，其占血液总量的50％～80％；中层呈白色，极薄，为白细胞；上层呈淡黄色，为富含血小板的血浆，分离上层后，即得到上层液。在本专利技术较佳的实施例中，第一次离心是将抗凝全血样品在100～200g的相对离心力下离心10～20min；优选为，将抗凝全血样品在150g的相对离心力下离心15min。这一条件能够满足在最大程度的沉降红细胞和白细胞的同时，又能避免血小板的沉降，从而避免血小板的损失。S2:再对上层液进行过滤处理以去除上层液中的白细胞。第一步离心后，通常会有部分白细胞悬浮在上层，为了进一步纯化血小板，在本专利技术中，采用过滤的方式将上层液中的白细胞去除，以得到高纯度的血小板。较为优选的，对上层液进行过滤处理时，所使用的过滤膜具有能够截留白细胞、且能够使血小板和血浆透过的微孔。这种过滤膜可商用购买。进一步的，在本专利技术较佳的实施例中，采用去白细胞过滤器对上层液进行过滤处理。由于去白细胞在临床上具有非常重要的意义，因此去白细胞过滤器已作为常规产品广泛应用在去除白细胞输血技术。这种去白细胞过滤器对白细胞的截流率高达90％以上，因此能够有效的去除上层液中混有的白细胞，从而提高血小板的纯度。更进一步优选的，为了避免血小板的损失，在对上层液进行过滤处理后，还包括用缓冲液洗涤去白细胞过滤器的步骤。该缓冲液为pH值例如可以为7.2～7.6的缓冲液。该缓冲液例如可以为台式缓冲液，其包括：134mM的NaCl、12mM的NaHCO3、2.9mM的KCl、0.34mM的Na2HPO4、1mM的MgCL2以及10mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸。当然也可以采用其他能够满足需求的缓冲液。在对上层液进行过滤处理时，可以采用加压的方式进行过滤，也可以直接进行常压过滤，即在重力的作用下过滤。采用加压的方式进行过滤时，由于上层液的流速较快，去白细胞过滤器对白细胞的截留量略低。此外，还应避免压力过大，导致细胞破裂、溶解的情况发生。优选的，在重力作用下，对上层液进行过滤处理。在重力作用下过滤，既能防止细胞破裂引起的污染，又能减缓过滤时上层液的流速，使得尽可能多的白细胞被截留。S3:随后对所得滤液进行第二次离心。在对上述滤液进行第二次离心后，血小板与血浆(及洗涤的缓冲液)分离，呈白色固体状沉淀在底部，且肉眼可见，将上层的上清液分离后，得到血小板沉淀，即为纯化后的血小板。在本专利技术较佳的实施例中，第二次离心是将滤液在1500～2500g的相对离心力下离心5～15min，更为优选的，将滤液在2000g的相对离心力下离心10min。这一条件是专利技术人在多年的理论研究和实践探索中得到的优选范围，采用这一条件进行第二次离心，能够在得到高纯度的血小板的同时，又能较大限度的避免血小板的损失。本专利技术提供的血小板的制备方法，适用于较少量的全血中的血小板的分离，通过这种方法能够有效的去除血小板中混有的白细胞，且能够有效避免血小板的意外损失，从而提高所制得的血小板的纯度和回收率。此外，这种方法的工艺步骤简单，所使用的试剂及设备均容易得到且价格低廉本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种血小板的制备方法，其特征在于，其包括：将抗凝全血样品进行第一次离心得到上层液；再对所述上层液进行过滤处理以去除所述上层液中的白细胞，得到滤液；随后对所述滤液进行第二次离心，保留沉淀。

【技术特征摘要】
1.一种血小板的制备方法，其特征在于，其包括：将抗凝全血样品进行第一次离心得到上层液；再对所述上层液进行过滤处理以去除所述上层液中的白细胞，得到滤液；随后对所述滤液进行第二次离心，保留沉淀。2.根据权利要求1所述的血小板的制备方法，其特征在于，过滤处理所述上层液的方法包括：采用过滤膜对所述上层液进行过滤，所述过滤膜具有能够截留白细胞、且能够使血小板透过的微孔。3.根据权利要求1所述的血小板的制备方法，其特征在于，过滤处理所述上层液的方法包括：采用去白细胞过滤器对所述上层液进行过滤。4.根据权利要求3所述的血小板的制备方法，其特征在于，过滤处理所述上层液的方法还包括：在采用去白细胞过滤器对所述上层液进行过滤后，用缓冲液洗涤所述去白细胞过滤器。5.根据权利要求1所述的血小板的...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋驰，
申请(专利权)人：武汉贝纳科技服务有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42