一种能辅助降解蛋白质并分泌抗菌肽的益生重组酿酒酵母制造技术

本发明专利技术公开了一种能辅助降解蛋白质并分泌抗菌肽的益生重组酿酒酵母，该重组酿酒酵母中含有辅助降解蛋白质并分泌抗菌肽的酿酒酵母多基因共表达载体，该载体中含有特定的蛋白酶基因和抗菌肽基因。本发明专利技术基因重组酿酒酵母能够实现蛋白酶降解，增加氮源或生产功能性小肽，同时分泌的抗菌肽具有抑制杂菌，促进机体生长和增强免疫等多种作用。此外，将不同特性的蛋白酶基因间的组合搭配，发挥不同蛋白酶对蛋白质降解的协同作用，其中重组酿酒酵母能够实现分泌不同pH范围的蛋白酶类，并不对抗菌肽基因进行降解，从而同步实现蛋白的降解和抗菌肽分泌等。

【技术实现步骤摘要】
一种能辅助降解蛋白质并分泌抗菌肽的益生重组酿酒酵母
本专利技术涉及基因工程和发酵工程等领域，更具体地，涉及一种能辅助降解蛋白质并分泌抗菌肽的重组酿酒酵母。
技术介绍
饲料原料中蛋白质成分一般比较丰富，一般需要通过蛋白酶类降解成肽类、氨基酸，进行再利用；许多益生菌类，例如芽孢杆菌以及黑曲霉或米曲霉等都会分泌蛋白酶，对环境中蛋白质成分进行分解利用，从而促进益生菌自身的菌体生长，但是酿酒酵母或乳酸菌分泌的蛋白酶类较少，对蛋白质物料降解能力较低，一般需要补充蛋白胨等蛋白质降解代谢物才能较好的生长；饲料中也一般采用酸性或中性蛋白酶。蛋白酶按照其作用方式，分为内切酶和外切酶，一般的微生物蛋白酶类通常分为内切酶和外切酶的混合物。饲用动物大多需要补充蛋白酶类，例如早期断奶仔猪常需要添加蛋白酶类，弥补体内分泌消化酶的不足。抗菌肽(antimicrobialpeptide)原指昆虫体内经诱导而产生的一类具有抗菌活性的碱性多肽物质，分子量在2000～7000左右，由20～60个氨基酸残基组成。这类活性多肽多数具有强碱性、热稳定性以及广谱抗菌等特点。抗菌肽抑制致病菌生长，不同抗菌肽对细菌、真菌、原虫以及病毒等具有不同杀伤能力；抗菌肽还具有选择性免疫激活和调节功能。酿酒酵母作为益生菌的重要组成部分。在酿酒酵母表达系统实现蛋白质降解酶类和抗菌肽的分泌表达，能够将两者的优点进行有机搭配：一方面分泌出来蛋白酶可以降解培养基中的蛋白质，增加氮源、促进目的益生菌生长；另一方面可以分泌抗菌肽，抑制杂菌。此外，表达的蛋白酶基因中，发挥了不同最适pH下的蛋白酶或不同酶切位点的蛋白酶之间的协同作用，因而能够更有效地对蛋白质原料进行降解，生产具有功能性的小肽或氨基酸等。在应用方面，利用酵母培养物饲养动物，能补充消化酶、增强免疫并促进生长；在餐厨废弃物中，降解废弃蛋白质、增加氮源、抑制杂菌。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是，为了克服现有技术的上述不足，提供一种能够在饲料添加、工业酒精生产、餐厨废弃物等能辅助降解蛋白质并分泌抗菌肽重组酿酒酵母。本专利技术是通过将酸性蛋白酶(Acidprotease)基因、中性蛋白酶(Neutralprotease)基因、天冬氨酸蛋白酶(Aspartic-typeEndopeptidase)基因、丝氨酸蛋白酶(SerineProtease)基因不同的搭配和优化，结合抗菌肽基因通过酿酒酵母共表达载体转入到酿酒酵母中。不同的蛋白酶基因基因间的不同搭配，可实现蛋白酶间的合理优化，有效发挥蛋白酶间的协同作用，同时分泌有抗菌活性的抗菌肽类，从而得到具有多功能益生重组酿酒酵母。本专利技术的目的在于提供一种能辅助降解蛋白质并分泌抗菌肽的酿酒酵母多基因共表达载体及其构建方法。本专利技术的另一目的在于提供一种能辅助降解蛋白质并分泌抗菌肽的益生重组酿酒酵母及其构建方法。本专利技术所采取的技术方案是：一种能辅助降解蛋白质并分泌抗菌肽的酿酒酵母多基因共表达载体，该载体中含有蛋白酶基因、抗菌肽基因；所述抗菌肽基因的碱基序列如SEQIDNO：5所示；所述蛋白酶基因选自酸性蛋白酶基因、中性蛋白酶基因、天冬氨酸蛋白酶基因、丝氨酸蛋白酶基因中的至少一种。进一步的，所述酸性蛋白酶基因的碱基序列如SEQIDNO：1所示，所述中性蛋白酶基因的碱基序列如SEQIDNO：2所示，所述天冬氨酸蛋白酶基因的碱基序列如SEQIDNO：3所示，所述丝氨酸蛋白酶基因的碱基序列如SEQIDNO：4所示。进一步的，所述蛋白酶基因为酸性蛋白酶基因和中性蛋白酶基因。进一步的，所述蛋白酶基因、抗菌肽基因上游均存在α-信号肽基因序列，α-信号肽基因的碱基序列如SEQIDNO：6所示。进一步的，所述蛋白酶基因基因的启动子选自pgk1-1、pgk1-2，终止子选自pgkt1-1、pgkt1-2；所述抗菌肽基因的启动子为pgk1-3，终止子为pgkt1-3；所述pgk1-1的碱基序列如SEQIDNO：7所示；所述pgkt1-1的碱基序列如SEQIDNO：8所示；所述pgk1-2的碱基序列如SEQIDNO：9所示；所述pgkt1-2的碱基序列如SEQIDNO：10所示；所述pgk1-3，的碱基序列如SEQIDNO：11所示；所述pgkt1-3的碱基序列如SEQIDNO：12所示。进一步的，所述载体的骨架为pGAPZaA质粒。进一步的，上述载体中含有酿酒酵母菌的25srDNA基因片段，其碱基序列如SEQIDNO：14所示。一种能辅助降解蛋白质并分泌抗菌肽的益生重组酿酒酵母，该重组酿酒酵母基因组中插入有上述任一所述的多基因共表达载体。上述任一所述一种能辅助降解蛋白质并分泌抗菌肽的酿酒酵母多基因共表达载体的构建方法，包括以下步骤：S1整合表达载体pTEGC-BsmBI构建：S1.1将G418抗性基因连入pGAPZaA质粒载体的多克隆位点MscI和EcoRV之间，获得载体pGAPZaA-G418；S1.2将碱基序列如SEQIDNO：14所示的rDNA基因序列的连入载体pGAPZaA-G418多克隆位点BamHI和EcoRI之间，获得载体pGAPZaA-G418-rDNA；S1.3将载体pGAPZaA-G418-rDNA经BglII和EcoRI双酶切后，回收大片段产物，得到线性化载体pTEGC，将碱基序列如SEQIDNO：15所示的BsmBI-2片段与线性化载体pTEGC连接，得整合表达载体pTEGC-BsmBI；S2启动子、终止子的扩增S2.1启动子的扩增：以酿酒酵母基因组DNA为模板，分别用引物对PGK1F1-BsmBI和PGK1R1-BsmBI、PGK1F2-BsmBI和PGK1R2-BsmBI、PGK1F3-BsmBI和PGK1R3-BsmBI分别扩增出pgk1-1、pgk1-2、pgk1-3启动子片段；S2.2终止子的扩增：以酿酒酵母基因组DNA为模板，分别用引物对PGKT1F1-BsmBI和PGKT1R1-BsmBI、PGKT1F2-BsmBI和PGKT1R2-BsmBI、PGKT1F3-BsmBI和PGKT1R3-BsmBI分别扩增出pgkt1-1、pgkt1-2、pgkt1-3终止子片段；S3α-信号肽基因、酸性蛋白酶基因、中性蛋白酶基因、抗菌肽基因的获得S3.1α-信号肽-酸性蛋白酶基因的获得：分别以含α-信号肽基因序列的T载体、含酸性蛋白酶基因基因序列的T载体为模板，通过引物MfaF1-BsmBI、Mfa-apR、Mfa-apF以及apR-BsmBI进行重叠延伸PCR将α-信号肽基因序列定向连入酸性蛋白酶基因基因的5’端，扩增出mfa-ap基因片段，即含有α-信号肽基因序列和酸性蛋白酶基因序列的片段；S3.2中性蛋白酶基因的获得：以含中性蛋白酶基因的T载体为模板，用引物npF-BsmBI以及npR-BsmBI进行扩增，获得含有IIs型限制性内切酶BsmBI的识别和切割位点的np基因片段；S3.3α-信号肽-抗菌肽基因的获得：分别以含α-信号肽基因序列的T载体、含抗菌肽的T载体为模板，通过引物MfaF3-BsmBI、Mfa-ampF、Mfa-ampR以及Mfa-ampR-BsmBI进行重叠延伸PCR将α-信号肽序列定向连入无信号肽的抗菌肽基因的5’端，扩增出mfa-amp基因片段，即本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种能辅助降解蛋白质并分泌抗菌肽的酿酒酵母多基因共表达载体，其特征在于：该载体中含有蛋白酶基因、抗菌肽基因；所述抗菌肽基因的碱基序列如SEQ ID NO：5所示；所述蛋白酶基因选自酸性蛋白酶基因、中性蛋白酶基因、天冬氨酸蛋白酶基因、丝氨酸蛋白酶基因中的至少一种。

【技术特征摘要】
1.一种能辅助降解蛋白质并分泌抗菌肽的酿酒酵母多基因共表达载体，其特征在于：该载体中含有蛋白酶基因、抗菌肽基因；所述抗菌肽基因的碱基序列如SEQIDNO：5所示；所述蛋白酶基因选自酸性蛋白酶基因、中性蛋白酶基因、天冬氨酸蛋白酶基因、丝氨酸蛋白酶基因中的至少一种。2.根据权利要求1所述的一种能辅助降解蛋白质并分泌抗菌肽的酿酒酵母多基因共表达载体，其特征在于：所述酸性蛋白酶基因的碱基序列如SEQIDNO：1所示，所述中性蛋白酶基因的碱基序列如SEQIDNO：2所示，所述天冬氨酸蛋白酶基因的碱基序列如SEQIDNO：3所示，所述丝氨酸蛋白酶基因的碱基序列如SEQIDNO：4所示。3.根据权利要求1所述的一种能辅助降解蛋白质并分泌抗菌肽的酿酒酵母多基因共表达载体，其特征在于：所述蛋白酶基因为酸性蛋白酶基因和中性蛋白酶基因。4.根据权利要求1所述的一种能辅助降解蛋白质并分泌抗菌肽的酿酒酵母多基因共表达载体，其特征在于：所述蛋白酶基因、抗菌肽基因上游均存在α-信号肽基因序列，α-信号肽基因的碱基序列如SEQIDNO：6所示。5.根据权利要求1~4任所述的一种能辅助降解蛋白质并分泌抗菌肽的酿酒酵母多基因共表达载体，其特征在于：所述蛋白酶基因基因的启动子选自pgk1-1、pgk1-2，终止子选自pgkt1-1、pgkt1-2；所述抗菌肽基因的启动子为pgk1-3，终止子为pgkt1-3；所述pgk1-1的碱基序列如SEQIDNO：7所示；所述pgkt1-1的碱基序列如SEQIDNO：8所示；所述pgk1-2的碱基序列如SEQIDNO：9所示；所述pgkt1-2的碱基序列如SEQIDNO：10所示；所述pgk1-3，的碱基序列如SEQIDNO：11所示；所述pgkt1-3的碱基序列如SEQIDNO：12所示。6.根据权利要求1~4任所述的一种能辅助降解蛋白质并分泌抗菌肽的酿酒酵母多基因共表达载体，其特征在于：所述载体的骨架为pGAPZaA质粒。7.根据权利要求1~4任所述的一种能辅助降解蛋白质并分泌抗菌肽的酿酒酵母多基因共表达载体，其特征在于：该载体中含有酿酒酵母菌的25srDNA基因片段，其碱基序列如SEQIDNO：14所示。8.一种能辅助降解蛋白质并分泌抗菌肽的益生重组酿酒酵母，其特征在于，该重组酿酒酵母基因组中插入有权利要求1~7任一所述的多基因共表达载体。9.权利要求1~7任一所述一种能辅助降解蛋白质并分泌抗菌肽的酿酒酵母多基因共表达载体的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：S1整合表达载体pTEGC-BsmBI构建：S1.1将G418抗性基因连入pGAPZaA质粒载体的多克隆位点MscI和EcoRV之间，获得载体pGAPZaA-G418;S1.2将碱基序列如SEQIDNO：14所示的rDNA基因序列的连入载体pGAPZaA-G418多克隆位点BamHI和EcoRI之间，获得载体pGAPZaA-G418-rDNA；S1.3将载体pGAPZaA-G418-rDNA经BglII和EcoRI双酶切后，回收大片段产物，得到线性化载体pTEGC，将碱基序列如SEQIDNO：15所示的BsmBI-2片段与线性化载体pTEGC连接，得整合表达载体pTEGC-BsmBI；S2启动子、终止子的扩增S2.1启动子的扩增：以酿酒酵母基因组DNA为模板，分别用引物对PGK1F1-BsmBI和PGK1R1-BsmBI、PGK1F2-BsmBI和PGK1R2-BsmBI、PGK1F3-BsmBI和PGK1R3-BsmBI分别扩增出pgk1-1、pgk1-2、pgk1-3启动子片段；S2.2终止子的扩增：以酿酒酵母基因组DNA为模板，分别用引物对PGKT1F1-BsmBI和PGKT1R1-BsmBI、PGKT1F2-BsmBI和PGKT1R2-BsmBI、PGKT1F3-BsmBI和PGKT1R3-BsmBI分别扩增出pgkt1-1、pgkt1-2、pgkt1-3终止子片段；S3α-信号肽基因、酸性蛋白酶基因、中性蛋白酶基因、抗菌肽基因的获得S3.1α-信号肽-酸性蛋白酶基因的获得：分别以含α-信号肽基因序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：张宏刚，李莉，
申请(专利权)人：广州格拉姆生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44