一种诱导间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法技术

一种诱导间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法，它涉及一种诱导间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法。本发明专利技术的目的是提供一种不同来源的间充质干细胞向胰岛样细胞分化的方法，进而获得大量的胰岛样细胞。为实现上述目标，具体方法如下：1)脐带、胎盘或脂肪来源间充质干细胞的分离及原代培养；2)分化培养基的制备包括：制备脑组织条件培养基(BTCM)、细胞分化诱导液以及干细胞条件培养基(SCM)；3)三阶段诱导间充质干细胞向胰岛样细胞分化；4)获得的胰岛样细胞的鉴定。通过本方法获得胰岛样细胞成熟度高，较少的细胞数量即可达到快速降糖作用，具有广阔的应用前景，本发明专利技术应用于生物医学领域。

【技术实现步骤摘要】
一种诱导间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法
本专利技术属于生物医学领域，特别涉及一种体外诱导干细胞向胰岛样细胞定向分化的方法及胰岛样细胞的应用。
技术介绍
糖尿病是一种慢性代谢性、多因素疾病，由绝对(I型糖尿病)和相对的(II型糖尿病)胰岛素缺乏导致高血糖症，两者之间的共同点均是胰岛β细胞功能不足，临床早期无明显症状，症状期会出现三多一少现象，常常伴随身体多系统的损害，严重伤害身体，甚至威胁生命。I型糖尿病的发病原因主要是自身免疫反应导致胰岛β细胞破坏，无法维持葡萄糖水平的稳定。胰岛移植，特别是对重症患者，是一种更直接的治疗方法，但由于供体缺乏、胰腺/胰岛分离费用高、移植产生的炎性反应需要多次移植和长期服用免疫排斥药物等问题而未能在临床上广泛应用。糖尿病患者胰岛功能的改善对延缓并发症的发生尤为重要，借助干细胞技术，在糖尿病患者体内重建内源性胰岛素分泌系统，成为再生医学领域中备受关注的研究方向。干细胞具有多向分化潜能，其中间充质干细胞(MSCs)是中胚层中具有高度自我更新和多向分化潜能的多能干细胞，广泛存在于全身多种组织中，可在体外培养扩增，并能在特定条件下分化为神经、汗腺、骨、软骨、脂肪、肝脏等多种组织细胞。脂肪、脐带和胎盘来源的MSC具有取材方便，传代能力强，免疫反应低，被污染的概率较小，无伦理学限制等优点，在一定条件下可分化为胰岛β细胞或胰岛素生成细胞(IPCs)，此方法成为替代现有短缺的胰岛细胞、实现临床糖尿病治疗的重要研究途径。研究表明，胰腺内分泌细胞来自内胚层，并且表达神经元标志物，同时在脊椎动物的大脑中发现胰岛素基因转录，这些结果都显示胰岛细胞与神经元存在相似之处，因此在神经元条件培养基的作用下可能更有益于胰岛样细胞的生长。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种诱导间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法，利用新出生的鼠大脑制备脑组织条件培养基(BTCM)，利用阿糖胞苷、尼克酰胺、B27、Conophylline等诱导间充质干细胞分化为胰岛样细胞，并通过进一步的鉴定来探讨间充质干细胞的分化潜能，同时寻找一种高效的胰岛样细胞的分化体系，为间充质干细胞分化为成熟胰岛样细胞的临床应用奠定基础。本专利技术的一种诱导间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法，它按照以下步骤进行：一、从脐带、胎盘或脂肪组织中分离获得间充质干细胞，并传代培养；二、分化培养基制备所述的分化培养基包括脑组织条件培养基、细胞分化诱导液和干细胞条件培养基；所述的脑组织条件培养基制备过程如下：在无菌条件下，取出生6～7天大鼠的大脑，用PBS或盐水清洗后，1000rpm离心6min，弃上清，用10％FBS的DMEM高糖培养基重悬沉淀，将脑组织捣碎为单个细胞，收集脑组织细胞用10％FBS的DMEM高糖培养1d后，加入浓度为1～2μmol/L的阿糖胞苷培养，在培养的第5d收集培养液，即为BTCM；所述的细胞分化诱导液成分为：以DMEM/F12为基础培养基，内含2％FBS、80～100μg/L长春碱衍生物和2％B27；所述的干细胞条件培养基制备过程如下：用含2％FBS、10mmol/L尼克酰胺的DMEM/F12培养基培养MSCs，3天后收集培养液即为SCM；三、将步骤一传代培养后的脐带、胎盘或脂肪组织间充质干细胞分化为胰岛样细胞，进行鉴定后，即完成所述的诱导间充质干细胞分化为胰岛样细胞。所述的长春碱衍生物为Conophylline。本专利技术包含以下有益效果：1)本专利技术所提供的诱导体系安全、无副作用，采用大鼠脑制备BTCM，其中包含多种天然诱导因子，联合尼克酰胺、Conophylline和B27等细胞因子的协同作用高效诱导胰岛素分泌细胞的生成。与传统方法相比，此次诱导体系使用细胞因子种类少且剂量少，降低临床使用风险。在最后阶段的SCM为胰岛素样细胞簇提供保护作用，克服了细胞易凋亡、分化不成熟、葡萄糖诱导毒性等缺点。2)本专利技术获得的胰岛样细胞分泌能力强。已报道的数据显示胰岛样细胞团在高葡萄糖刺激下，胰岛素分泌量约为50～70mU/L，而本专利技术诱导的胰岛样细胞团具有更高、更快的胰岛素分泌能力，在低糖刺激下已达到(33.88±4.05mU/L)，高糖作用下达到(105.65±7.43mU/L)，很大程度上提高了胰岛样细胞的胰岛素分泌能力，对葡萄糖刺激做出快速反应，达到快速降低血糖的功能。本专利技术的诱导方法与传统的多细胞因子联合诱导相比，可获得更多并且成熟的胰岛样细胞，显著提高诱导分化效率，同时已分化的胰岛样细胞存活时间长、增殖活性高，在葡萄糖刺激下能在较短的时间内作出快速反应，达到快速降糖作用。同时，本专利技术方法无需基因转染，避免基因改变和致瘤风险，具有广阔的应用前景。附图说明图1为胰岛样细胞的双硫腙染色图；图2为基因表达情况图；图3为胰岛素的分泌受外环境糖的调节结果图；图4为胰岛样细胞移植后分别在第3天、10天大鼠血糖水平图。具体实施方式具体实施方式一：本实施方式的一种诱导间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法，它按照以下步骤进行：一、从脐带、胎盘或脂肪组织中分离获得间充质干细胞，并传代培养；二、分化培养基制备所述的分化培养基为脑组织条件培养基、细胞分化诱导液和干细胞条件培养基；所述的脑组织条件培养基制备过程如下：在无菌条件下，取出生6～7天大鼠的大脑，用PBS或盐水清洗后，1000rpm离心6min，弃上清，用10％FBS的DMEM高糖培养基重悬沉淀，将脑组织捣碎为单个细胞，收集脑组织细胞用10％FBS的DMEM高糖培养1d后，加入浓度为1～2μmol/L的阿糖胞苷培养，在培养的第5d收集培养液，即为BTCM；所述的细胞分化诱导液成分为：以DMEM/F12为基础培养基，内含2％FBS、80～100μg/L长春碱衍生物和2％B27；所述的干细胞条件培养基制备过程如下：用含2％FBS、10mmol/L尼克酰胺的DMEM/F12培养基培养MSCs，3天后收集培养液即为SCM；三、将步骤一传代培养后的脐带、胎盘或脂肪组织间充质干细胞分化为胰岛样细胞，进行鉴定后，即完成所述的诱导间充质干细胞分化为胰岛样细胞。具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：所述的将步骤一传代培养后的脐带、胎盘或脂肪组织间充质干细胞分化为胰岛样细胞具体过程如下：将步骤一传代培养至P3代的脐带、胎盘或脂肪组织的间充质干细胞以4×104个/mL接种量接种于6孔板中，以含10％FBS的DMEM/F12的培养基进行培养，培养24h后更换BTCM培养7天，每2日更换一次BTCM，培养7天后，再用细胞分化诱导液培养7天，每2日换一次诱导液，然后用细胞分化诱导液和SCM按体积比为1:1的比例联合共同培养14天，即获得成熟的胰岛样细胞。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是：所述的脐带间充质干细胞分离及传代培养过程如下：取足月胎儿脐带15～20cm，经过生理盐水和体积百分含量为75％酒精清洗后，剪成长度为2～3cm，分别将动脉和静脉剥离，将中间的华通氏胶分离出来，在无菌条件下剪成0.5～2mm3组织块，按照1g/T75瓶接种，采用10％FBS培养基进行培养，5d后进行换液，待细胞融合度达到80％以上后，通过体积百分浓度为0.125％的胰酶进行消化，获取单个细胞，按照本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种诱导间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法，其特征在于它按照以下步骤进行：一、从脐带、胎盘或脂肪组织中分离获得间充质干细胞，并传代培养；二、分化培养基制备所述的分化培养基包括脑组织条件培养基、细胞分化诱导液和干细胞条件培养基；所述的脑组织条件培养基制备过程如下：在无菌条件下，取出生6～7天大鼠的大脑，用PBS或盐水清洗后，1000rpm离心6min，弃上清，用10％FBS的DMEM高糖培养基重悬沉淀，将脑组织捣碎为单个细胞，收集脑组织细胞用10％FBS的DMEM高糖培养1d后，加入浓度为1～2μmol/L的阿糖胞苷培养，在培养的第5d收集培养液，即为BTCM；所述的细胞分化诱导液成分为：以DMEM/F12为基础培养基，内含2％FBS、80～100μg/L长春碱衍生物和2％B27；所述的干细胞条件培养基制备过程如下：用含2％FBS、10mmol/L尼克酰胺的DMEM/F12培养基培养MSCs，3天后收集培养液即为SCM；三、将步骤一传代培养后的脐带、胎盘或脂肪组织间充质干细胞分化为胰岛样细胞，进行鉴定后，即完成所述的诱导间充质干细胞分化为胰岛样细胞。

【技术特征摘要】
1.一种诱导间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法，其特征在于它按照以下步骤进行：一、从脐带、胎盘或脂肪组织中分离获得间充质干细胞，并传代培养；二、分化培养基制备所述的分化培养基包括脑组织条件培养基、细胞分化诱导液和干细胞条件培养基；所述的脑组织条件培养基制备过程如下：在无菌条件下，取出生6～7天大鼠的大脑，用PBS或盐水清洗后，1000rpm离心6min，弃上清，用10％FBS的DMEM高糖培养基重悬沉淀，将脑组织捣碎为单个细胞，收集脑组织细胞用10％FBS的DMEM高糖培养1d后，加入浓度为1～2μmol/L的阿糖胞苷培养，在培养的第5d收集培养液，即为BTCM；所述的细胞分化诱导液成分为：以DMEM/F12为基础培养基，内含2％FBS、80～100μg/L长春碱衍生物和2％B27；所述的干细胞条件培养基制备过程如下：用含2％FBS、10mmol/L尼克酰胺的DMEM/F12培养基培养MSCs，3天后收集培养液即为SCM；三、将步骤一传代培养后的脐带、胎盘或脂肪组织间充质干细胞分化为胰岛样细胞，进行鉴定后，即完成所述的诱导间充质干细胞分化为胰岛样细胞。2.根据权利要求1所述的一种诱导间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法，其特征在于所述的将步骤一传代培养后的脐带、胎盘或脂肪组织间充质干细胞分化为胰岛样细胞具体过程如下：将步骤一传代培养至P3代的脐带、胎盘或脂肪组织的间充质干细胞以4×104个/mL接种量接种于6孔板中，在含10％FBS的DMEM/F12进行培养，培养24h后更换BTCM培养7天，每2日更换一次BTCM，培养7天后，再用细胞分化诱导液培养7天，每2日换一次诱导液，然后用细胞分化诱导液和SCM按体积比为1:1的比例联合共同培养14天，即获得成熟的胰岛样细胞。3.根据权利要求1所述的一种诱导间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法，其特征在于所述的脐带间充质干细胞分离及传代培养过程如下：取足月胎儿脐带15～20cm，经过生理盐水和体积百分含量为75％酒精清洗后，剪成长度为2～3cm，分别将动脉和静脉剥离，将中间的华通氏胶分离出来，在无菌条件下剪成0...

【专利技术属性】
技术研发人员：孟庆雪，张怡，刘艳青，
申请(专利权)人：黑龙江天晴干细胞股份有限公司，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23