一种抑制剂及其在抑制几丁质酶和己糖胺酶活性中的应用制造技术

本发明专利技术公开一种高效抑制几丁质酶OfChi‑h和己糖胺酶OfHex1活性的化合物的应用，涉及化合物phlegmacin B1及其衍生物在抑制几丁质酶OfChi‑h和己糖胺酶OfHex1活性中，使用的终浓度为不低于13ppm，此浓度下测得的抑制率分别为90.4％和71.4％，抑制常数K

【技术实现步骤摘要】
一种抑制剂及其在抑制几丁质酶和己糖胺酶活性中的应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种真菌次级代谢产物的杀虫活性。
技术介绍
几丁质(Chitin)是以N-乙酰-β-D-葡萄糖胺(GlcNAc)为基本单元，通过β-1,4糖苷键连接的天然线性直链多糖。作为重要的结构组成部分，几丁质大量存在于真菌和硅藻的细胞壁、软体动物的外壳、线虫的卵壳以及甲壳类生物和昆虫的外骨骼中，其合成和水解的动态平衡对于这些生物的生长发育具有极其重要的作用。目前已知有两类糖基水解酶参与了几丁质的水解，分别是来自糖基水解酶18家族的几丁质酶(EC3.2.1.14)和来自糖基水解酶20家族的具有几丁质水解活性的β-N-乙酰-D-己糖胺酶(EC3.2.1.52)，前者将多聚几丁质降解成为几丁寡糖，后者将几丁寡糖进一步水解成为GlcNAc。针对家蚕蜕皮液的蛋白质组分析发现，几丁质酶Chi-h、ChtI和ChtII以及己糖胺酶Hex1参与了家蚕的蜕皮过程，同时对不同生物的RNA干扰实验也表明，当上诉糖基水解酶的表达被干扰后，昆虫会因为蜕皮不正常而死亡。因此，将18家族几丁质酶和20家族己糖胺酶作为农药设计的靶点，开发高效的糖基水解酶抑制剂对于农业害虫的防治具有非常重要的意义。目前已知的抑制剂往往只能专一性地抑制某一家族的糖基水解酶，而同时针对18家族几丁质酶和20家族己糖胺酶的抑制剂报道较少，TGM-(GlcNAc)2-4和NGT衍生物是目前发现的同时对几丁质酶和己糖胺酶都具有抑制效果的抑制剂。前者对来源于亚洲玉米螟的己糖胺酶OfHex1和几丁质酶OfChi-h均具有较高的抑制活性，后者是在己糖胺酶抑制剂NGT的基础上通过进一步的衍生化获得的。这些抑制剂虽然对几丁质酶和己糖胺酶都表现出较高的抑制活性，但是复杂的分子结构使得其合成困难，生产成本很高，这限制了抑制剂的进一步衍生化和应用，所以有必要进行新的抑制剂的筛选和开发。微生物的次级代谢产物是微生物在生长过程中产生的对该生物无明显生理功能的一类小分子，这些天然小分子在后续的大规模生产以及进一步的衍生化和应用上较之复杂的化学合成化合物有较大的优势，因此在抑制剂的筛选过程中往往是非常重要的筛选对象。化合物phlegmacinB1，是伞菌Cortinariusodorifer分泌的次级代谢产物，与伞菌的颜色形成密切相关，然而到目前为止，针对化合物phlegmacinB1的生物活性的报道很少，特别是针对糖基水解酶的生物活性还没有报导。因此，研究发现化合物phlegmacinB1的生物活性对于扩展其应用有非常积极的意义。
技术实现思路
在防治农业害虫的研究中，为了找到高效的糖基水解酶抑制剂，尤其是寻找到一种同时对几丁质酶和己糖胺酶都具有抑制效果的抑制剂，本专利技术筛选了大量的化合物，通过圆二色谱鉴定，抑制效果、选择性和杀虫活性评价对多种化合物的结构和抑制活性进行了抑制效果评价研究，最终筛选到了一种多靶点抑制剂，并且验证了其是对亚洲玉米螟具有显著杀虫效果的多靶点抑制剂。首先，本专利技术公开一种抑制几丁质酶和己糖胺酶活性的多靶点抑制剂，其结构式如图1B所示，即phlegmacinB1。另外，本专利技术公开所述的抑制剂的衍生物，其结构式如下所示：本专利技术还公开所述的抑制剂和/或其衍生物在抑制几丁质酶和己糖胺酶活性中的应用。具体的，所述抑制剂和/或其衍生物在抑制几丁质酶和己糖胺酶活性中使用的终浓度为不低于13ppm。本专利技术还公开所述的抑制剂在防治农业害虫方面的应用。具体的所述的农业害虫是鳞翅目昆虫，包括麦蛾、棉红铃虫、马铃薯块茎蛾、甘薯麦蛾、棉褐带卷蛾、大豆食心虫、梨大食心虫、亚洲玉米螟、大造桥虫、菜粉蝶、棉铃虫、舞毒蛾、玉带风蝶、金凤蝶、舟形毛虫、黄腹灯蛾、红腹灯蛾、美国白蛾、葡萄天蛾和稻苞虫等。本专利技术提供了评价化合物phlegmacinB1抑制活性所获得的数据，包括抑制剂筛选、抑制常数测定和选择性测定所获得的数据。结果表明，在筛选的所有556个微生物次级代谢产物中，化合物phlegmacinB1(终浓度13ppm)对几丁质酶OfChi-h和己糖胺酶OfHex1的抑制率分别为90.4％和71.4％，抑制常数Ki分别为5.5μM和26μM。对化合物的适用对象测定表明，在20μM终浓度下，化合物phlegmacinB1对几丁质酶OfChi-h和己糖胺酶OfHex1表现出较高的抑制活性，对于其他来源的几丁质酶和己糖胺酶(除了粘质沙雷氏菌来源的SmChiC之外)也同样表现出一定的抑制活性。综上，化合物phlegmacinB1针对不同物种来源的几丁质酶和己糖胺酶均能表现出抑制活性，同时根据抑制常数可以推断，当化合物phlegmacinB1的浓度≥5μM时，对几丁质酶OfChi-h有较强抑制活性，当其浓度≥30μM时，对己糖胺酶OfHex1表现出较强抑制活性。本专利技术还公开一种评价化合物杀虫活性的方法，具体是用二甲基亚砜作为溶剂溶解化合物，采用注射方式直接将化合物导入研究对象体内。对于本申请而言，所述评价化合物杀虫活性的方法中所述化合物为上文所述的抑制剂phlegmacinB1及其衍生物。传统的研究化合物杀虫活性的手段往往是将化合物与饲喂的食物混合，通过虫子本身的摄食将化合物导入体内，但这样的方式往往存在很多问题。因为化合物本身的颜色、气味等的影响，虫子会对混合有化合物的食物产生拒食反应，此外，通过摄食进入虫子体内的化合物需要经过消化系统，在这一过程中化合物的结构往往会遭到破坏，而且因为化合物本身的水溶性、亲脂性等的性质，往往不能很好地被虫子吸收进入血淋巴到达作用靶点。上述种种因素均会对杀虫活性的评价产生影响。本专利技术提出的评价化合物杀虫活性的方法的创新点之一在于采用注射方式代替传统的喂食方式直接将化合物导入研究对象亚洲玉米螟体内，这样就避免了拒食、化合物结构被破坏等的影响。此外，该方法的另一个创新点在于用二甲基亚砜DMSO代替水作为溶剂溶解化合物，这保证了化合物的高溶解性，从而更好的被虫子吸收，到达作用靶点。事实上，对虫子表型的分类统计也不同于以往只针对死亡率的统计方式，在该统计方式下可以较好地观察到虫子各个表型的死亡率，从而更好地研究化合物的作用方式。经过研究化合物phlegmacinB1在0.5μM浓度下对亚洲玉米螟的杀虫活性可以发现，相较于对照组，实验组有34.15％的幼虫在注射0.5μM化合物的10天内陆续死亡，有31.7％的幼虫则因为蜕皮不正常无法形成正常的蛹。附图说明图1是化合物phlegmacinB1的圆二色谱图(图A)及结构式(图B)。其中图A的横坐标表示平面偏振光的波长λ，单位为nm；纵坐标表示吸收系数之差Δε，单位为cm2/mol；图中曲线反映在不同的波长下，化合物phlegmacinB1对组成平面偏振光的左旋和右旋圆偏振光的吸收系数的差异，其中276nm处的吸收系数之差为化合物phlegmacinB1的特征吸收峰，对应图B的结构式。图2为化合物phlegmacinB1对OfChi-h(图A)和OfHex1(图B)的抑制常数Ki测定示意图。其中横坐标[I]表示化合物phlegmacinB1的浓度，单位为μM；纵坐标1/v表示反应速率的倒数；图中3条直线对应不同的底物浓度下，1/v随化合物phlegmac本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种同时抑制几丁质酶和己糖胺酶的抑制剂，其特征在于：其结构式如下所示：

【技术特征摘要】
1.一种同时抑制几丁质酶和己糖胺酶的抑制剂，其特征在于：其结构式如下所示：2.如权利要求1所述的抑制剂的衍生物，其特征在于：其结构式如下所示：3.如权利要求1和/或2所述的抑制剂和/或其衍生物在抑制几丁质酶和己糖胺酶活性中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：权利要求1和/或2所述的抑制剂和/或其衍生物在抑制几丁质酶和己糖胺酶活性中使用的终浓度为不低于13ppm。5.如权利要求1所述的抑制剂在防治农业害虫方面的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的农业害虫是鳞...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨青，刘田，陈磊，段燕伟，路新华，
申请(专利权)人：大连理工大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21