一种基于双抗体夹心法检测雌酚和双酚A的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于双抗体夹心法检测雌酚和双酚A的方法。所述的方法为：首先制备表面修饰纳米金‑巯基乙酸‑己烷雌酚单克隆抗体的电化学免疫传感器，然后采用双抗体夹心法对待测样品中的雌酚或双酚A进行检测，通过相关数据的分析与推导，即可得到雌酚或双酚A的浓度。本发明专利技术提供的方法检测己烯雌酚的检测限为0.06ng/mL，线性范围为0.5～1000ng/mL；检测己烷雌酚的检测限为0.052ng/mL，线性范围为0.5～1000ng/mL；检测己二烯雌酚的检测限为0.047ng/mL，线性范围为0.5～500ng/mL；检测双酚A的检测限为0.037ng/mL，线性范围为0.5～500ng/mL。本发明专利技术所述的检测方法快速、高效、灵敏度高，具有很低的检测限和较宽的线性范围。

【技术实现步骤摘要】
一种基于双抗体夹心法检测雌酚和双酚A的方法
本专利技术属于食品安全检测和分析化学
，涉及一种基于双抗体夹心法的电化学免疫检测方法，具体的说是一种基于双抗体夹心法检测雌酚和双酚A的方法。
技术介绍
己烯雌酚(diethylstilbestrol，DES)、己烷雌酚(hexestrol，HEX)和己二烯雌酚(dienestrol，DIEN)(结构见式1)属于人工合成的雌激素类物质(以下简称雌酚)，具有促进动物生长、提高饲料转化率和减少脂肪合成等作用，20世纪60年代曾广泛应用于畜牧业生产。这类人工激素可通过食物链干扰人体正常的激素平衡，危害人类健康，如导致机体代谢紊乱、发育异常、乳腺癌和胎儿畸形等严重的问题，在我国和欧美等国家都明令禁止在动物养殖过程中使用。双酚A(bisphenolA，BPA)(结构见式1)从60年代以来就被广泛应用于制造塑料(奶)瓶、幼儿用的吸口杯、食品和饮料(奶粉)罐内侧涂层，从矿泉水瓶、医疗器械到食品包装的内里，都有它的身影，可说是无处不在。双酚A的结构和性质与雌酚类似，能导致内分泌失调，此外癌症和新陈代谢紊乱导致的肥胖也被认为与其有关。欧盟认为含双酚A的奶瓶会诱发性早熟，从2011年3月2日起，禁止生产含双酚A的婴儿奶瓶。目前用于雌酚和双酚A的检测的方法主要有高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法、毛细管电泳法等。但是这些分析方法需要大型分析仪器，检测时间长、成本高，因此有必要建立更加高效、快速、灵敏的分析测试方法。双抗体夹心法通常被用于大分子抗原(如蛋白质、病毒、肿瘤标志物等)的分析检测，而小分子化合物由于体积较小，通常无法同时结合两个抗体，因此小分子化合物一般难以用双抗体夹心法进行检测。雌酚及双酚A皆为具有对称结构的双官能团线型分子，从理论上讲可以和两个抗体同时结合，是本专利技术采用双抗体夹心法检测雌酚及双酚A的基础。
技术实现思路
本专利技术提供了一种基于双抗体夹心法的检测雌酚和双酚A的方法，所述的方法快速、高效、灵敏度高，具有很低的检测限(0.037～0.060ng/mL)和较宽的线性范围(0.5～1000ng/mL或0.5～500ng/mL)。本专利技术所采用的技术方案包括如下步骤：1)纳米金-巯基乙酸-己烷雌酚单克隆抗体修饰的电化学免疫传感器的制备：先将纳米金颗粒通过电化学还原法沉积到处理好的玻碳电极表面，然后通过自组装法将巯基乙酸修饰到纳米金颗粒表面，最后采用活化羧基法将己烷雌酚单克隆抗体偶联到电极表面修饰的纳米金颗粒上，制得电化学免疫传感器；2)标准溶液的配制：配制含有雌酚或双酚A的磷酸缓冲溶液，作为标准溶液，将含有浓度为0的雌酚或双酚A的标准溶液作为空白标样；3)工作曲线的建立：首先将步骤1)所述电化学免疫传感器浸入步骤2)所述标准溶液中孵育，孵育后用磷酸缓冲溶液冲洗电化学免疫传感器，然后将其浸入含有0.5mg/L的己烷雌酚单克隆抗体的溶液中进行孵育，之后以磷酸缓冲溶液冲洗，再将其在K3[Fe(CN)6]溶液中进行差分脉冲伏安扫描，记录其响应电流；空白标样对应的响应电流记为I0，含有雌酚或双酚A标样的响应电流记为Ix，响应电流的变化值ΔI等于Ix与I0之差的绝对值；将所述ΔI与标准溶液中雌酚或双酚A浓度的对数值lgC绘制成ΔI-lgC工作曲线，采用线性回归法得到ΔI-lgC线性回归方程；4)雌酚和双酚A的测定：配置含有待测样品的磷酸缓冲溶液，按照与步骤3)相同的方法对所述免疫传感器进行孵育和差分脉冲伏安扫描，记录响应电流；根据响应电流的变化值ΔI和ΔI-lgC线性回归方程，得到雌酚和双酚A的含量。所述纳米金-巯基乙酸-己烷雌酚单克隆抗体修饰的电化学免疫传感器采用以下方法制备：首先将清洁干净的玻碳电极浸入质量百分浓度为0.5％的氯金酸溶液中，采用恒电位法将氯金酸还原为纳米金颗粒从而沉积于玻碳电极表面；然后将玻碳电极置于1mmol/L的巯基乙酸水溶液中，通过自组装的方法在纳米金颗粒表面修饰巯基乙酸；再将玻碳电极置于含有0.1mol/L的N-溴代琥珀酰亚胺和0.1mol/L的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液中，活化羧基；在上述活化羧基后的玻碳电极表面滴涂质量浓度为0.5mg/L的己烷雌酚单克隆抗体，4℃条件下反应，制得所述的纳米金-巯基乙酸-己烷雌酚单克隆抗体修饰的电化学免疫传感器。所述雌酚分别为己烯雌酚、己烷雌酚和己二烯雌酚。以所述空白标样的测定值标准偏差的3倍作为样品检测限，重复步骤3)可得出雌酚或双酚A样品的检测限。本专利技术的方法可用于多种实际样品中雌酚和双酚A的检测，所述实际样品包括但不限于食品、土壤、水质、塑料等。本专利技术提供的方法用于雌酚和双酚A的检测，其检测限分别为己烯雌酚0.060ng/mL、己烷雌酚0.052ng/mL、己二烯雌酚0.047ng/mL、双酚A0.037ng/mL；线性范围为己烯雌酚和己烷雌酚0.5～1000ng/mL、己二烯雌酚和双酚A0.5～500ng/mL。本专利技术具有如下的有益效果：由于采用了双抗体夹心法，提高了检测灵敏度，检测限很低(0.037～0.060ng/mL)，同时具有较宽的线性范围(0.5～1000ng/mL或0.5～500ng/mL)。本专利技术的保护范围并不以具体实施方式为限，而是由权利要求加以限定。附图说明图1为电化学免疫传感器对己烯雌酚进行检测的DPV曲线图。图2为响应电流的变化值ΔI与己烯雌酚浓度对数值lgC的工作曲线图。图3为电化学免疫传感器对己烷雌酚进行检测的DPV曲线图。图4为响应电流的变化值ΔI与己烷雌酚浓度对数值lgC的工作曲线图。图5为电化学免疫传感器对己二烯雌酚进行检测的DPV曲线图。图6为响应电流的变化值ΔI与己二烯雌酚浓度对数值lgC的工作曲线图。图7为电化学免疫传感器对双酚A进行检测的DPV曲线图。图8为响应电流的变化值ΔI与双酚A浓度对数值lgC的工作曲线图。具体实施方式下面通过具体实施例结合附图对本专利技术所述的技术方案给予进一步详细的说明，但有必要指出以下实施例只用于对
技术实现思路
的描述，并不构成对本专利技术保护范围的限制。实施例1对己烯雌酚标准样品的检测1)电化学免疫传感器的制备：将直径为3mm的玻碳电极依次用0.3μm和0.05μm的氧化铝粉末在抛光绒布上打磨，依次用无水乙醇-蒸馏水(V/V＝1/1)、蒸馏水超声清洗30s，再用蒸馏水冲洗干净。将上述电极插入0.5％的氯金酸溶液中进行恒电位电化学沉积(电压为-0.2V，沉积时间60s)，用去离子水冲洗干净后浸入1mmol/L的巯基乙酸溶液中，置于37℃下反应8小时。将上述电极用蒸馏水冲洗干净后置于含0.1mol/L的N-溴代琥珀酰亚胺(NHS)和0.1mol/L的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)的2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)缓冲溶液中，活化羧基40分钟。在上述活化羧基后的电极表面滴涂50μL己烷雌酚单克隆抗体(0.5mg/L)，置于冰箱中4℃过夜后，用去离子水冲洗干净并浸泡在5％的牛血清白蛋白(BSA)溶液中，在37℃烘箱中孵育30分钟，以封闭剩余的活性位点，即可得到纳米金-巯基乙酸-己烷雌酚单克隆抗体修饰的电化学免疫传感器。2)己烯雌酚标准样品的检测将步骤1)中所述的电化本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于双抗体夹心法检测雌酚和双酚A的方法，包括以下步骤：1)纳米金‑巯基乙酸‑己烷雌酚单克隆抗体修饰的电化学免疫传感器的制备：先将纳米金颗粒通过电化学还原法沉积到处理好的玻碳电极表面，然后通过自组装法将巯基乙酸修饰到纳米金颗粒表面，最后采用活化羧基法将己烷雌酚单克隆抗体偶联到电极表面修饰的纳米金颗粒上，制得电化学免疫传感器；2)标准溶液的配制：配制含有雌酚或双酚A的磷酸缓冲溶液，作为标准溶液，将含有浓度为0的雌酚或双酚A的标准溶液作为空白标样；3)工作曲线的建立：首先将步骤1)所述电化学免疫传感器浸入步骤2)所述标准溶液中孵育，孵育后用磷酸缓冲溶液冲洗电化学免疫传感器，然后将其浸入含有0.5mg/L的己烷雌酚单克隆抗体的溶液中进行孵育，之后以磷酸缓冲溶液冲洗，再将其在K

【技术特征摘要】
1.一种基于双抗体夹心法检测雌酚和双酚A的方法，包括以下步骤：1)纳米金-巯基乙酸-己烷雌酚单克隆抗体修饰的电化学免疫传感器的制备：先将纳米金颗粒通过电化学还原法沉积到处理好的玻碳电极表面，然后通过自组装法将巯基乙酸修饰到纳米金颗粒表面，最后采用活化羧基法将己烷雌酚单克隆抗体偶联到电极表面修饰的纳米金颗粒上，制得电化学免疫传感器；2)标准溶液的配制：配制含有雌酚或双酚A的磷酸缓冲溶液，作为标准溶液，将含有浓度为0的雌酚或双酚A的标准溶液作为空白标样；3)工作曲线的建立：首先将步骤1)所述电化学免疫传感器浸入步骤2)所述标准溶液中孵育，孵育后用磷酸缓冲溶液冲洗电化学免疫传感器，然后将其浸入含有0.5mg/L的己烷雌酚单克隆抗体的溶液中进行孵育，之后以磷酸缓冲溶液冲洗，再将其在K3[Fe(CN)6]溶液中进行差分脉冲伏安扫描，记录其响应电流；空白标样对应的响应电流记为I0，含有雌酚或双酚A标样的响应电流记为Ix，响应电流的变化值ΔI等于Ix与I0之差的绝对值；将所述ΔI与标准溶液中雌酚或双酚A浓度的对数值lgC绘制成ΔI-lgC工作曲线，采用线性回归法得到ΔI-lgC线性回归方程；4)雌酚和双酚A的测定：配置含有待测样品的磷酸缓冲溶液，按照与步骤3)相同的方法对所述免疫传感器进行孵育和差分脉冲伏安扫描，记录响应电流；根据响应电流的变化值ΔI...

【专利技术属性】
技术研发人员：邵科峰，魏梦，赵波，王雅娟，朱永强，
申请(专利权)人：南京师范大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32